[发明专利]能够由至少一种戊糖生产乙醇的工业酵母

说明书

发明领域

本发明涉及用于获得产乙醇酵母菌株的方法的领域，由此而产生的酵母以及通过所述酵母进行的乙醇工业生产的领域。更为特别地，本发明在其最一般的方面涉及由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)“工业”菌株制备酵母的方法、涉及所述的酵母并且涉及其在由包含至少一种戊糖的工业培养基工业生产乙醇中的用途。

背景技术

本领域现有技术方法的共同点在于致力于使用已知的和/或构建的基因遗传性改善“实验室”菌株的方法，并且通常在培养基中和在标准化和最优的实验室条件下研究其产生乙醇的能力。

实际上，经本申请人分析的科技文献和专利文件最为普遍地教导了用于获得单倍体或二倍体菌株的方法，其对于应激(特别是高浓度的乙醇)和/或对于高温和/或对于发酵抑制剂有弱的耐受性。此外，这些方法多数需要这些菌株具有使用营养缺陷型标记和/或抗生素抗性标记的资源，这可防止这些菌株随后用于工业培养基中，这是由于明显的成本原因，或者甚至在一些情况下由于公共健康原因。

此前开发的这些菌株的生长特性通常不够充分，并且这些菌株从未面对工业规模的生物质生产的需求，即，仅举例来说以下三种：高生长速率、被干燥的能力、储存稳定性。

虽然使用这些现有技术菌株在合成的或限定性的“实验室”培养基中获得了“发酵”性能水平(厌氧条件下生产乙醇的能力)，但它们通常不能转换到包含例如由处理纤维素或木质纤维素材料的残余物(其包含可在不同水平上抑制所述酵母的细胞机制的毒性化合物，特别是糠醛、HMF、酚衍生物和乙酸)所产生的复杂混合物的工业培养基。此外，这些现有技术的乙醇生产过程进行放大的能力罕有记载。

本申请人因此注意到对于制备“工业”酵母的方法仍存在需求，所述方法将对酵母制备的制约及同时其应用中最终用户的约束加以考虑，特别是以低成本和高产量进行乙醇的工业生产的方法。

发明内容

本发明目的正是在于满足该双重需求。

因此，本发明的第一个主题是用于制备能够由包含至少一种戊糖的培养基生产乙醇的酿酒酵母工业酵母菌株的方法，并且其包括下列步骤：

(i)选择并且获得能够在同步糖化发酵(SSF)的条件下和35℃的温度下以谷物水解物产生高浓度乙醇的酿酒酵母“工业”酵母菌株，所述乙醇浓度至少为14.5％(v/v)，并且优选地至少为16％，

(ii)将至少一个表达盒或删除盒(deletion cassette)整合到步骤(i)的酵母基因组中，所述至少一个盒选自以下组成的组：

a.编码使用NADH；H+而非NADPH；H+作为优先辅因子的突变木糖还原酶的树干毕赤酵母(Pichia stipitis)XRm基因/酿酒酵母启动子和终止子的开放阅读框(ORF)型的结合，所述盒上游和下游侧邻有使其靶向整合到所述基因组中的重组区域(recombinogenic region)，

b.编码木糖醇脱氢酶的树干毕赤酵母XDH基因/酿酒酵母启动子和终止子的开放阅读框(ORF)型的结合，所述盒上游和下游侧邻有使其靶向整合到所述基因组中重组区域，

c.编码木酮糖激酶的酿酒酵母XKS1基因/酿酒酵母启动子和终止子的开放阅读框(ORF)型的结合，所述盒上游和下游侧邻使其靶向整合到所述基因组中的重组区域，

(iii)通过将戊糖磷酸途径的非氧化部分中的各步骤的至少一种基因置于在乙醇发酵过程中强表达的糖酵解基因启动子的控制下而诱导其表达，以及

(iv)删除编码醛糖脱氢酶的酿酒酵母GRE3基因的开放阅读框(ORF)的至少两个拷贝。

本发明的方法特别地具有以下优点：

对于酵母制造商，其使得可能：

—构建原养型非整倍体/多倍体(aneu/polyploid)酿酒酵母酵母菌株以允许以廉价培养基(诸如糖工业的副产物，例如废蜜)中的简单碳源、氮源和磷源生产生物质，

—具有表现出0.37h^-1至0.5h^-1的最大生长速度(μmax)的酿酒酵母酵母菌株，

—具有当根据描述于参考书《Yeast Technology》(第2版，1991年，G.Reed和T.W.Nagodawithana，Van Nostrand Reinhold出版，ISBN 0-442-31892-8)中的方法制备时，使得能够获得至少45g的酵母干物质每100g处理蔗糖当量的生物质产率的酿酒酵母酵母菌株，