[发明专利]能够由至少一种戊糖生产乙醇的工业酵母

权利要求书

1.一种用于制备能够从包含至少一种戊糖的培养基生产乙醇的酿酒酵母工业酵母菌株的方法，并且其包含以下步骤：

(i)选择并且获得能够在同步糖化发酵(SSF)条件下和35℃的温度下以谷物水解物产生高浓度乙醇的酿酒酵母“工业”酵母菌株，所述乙醇浓度至少为14.5％(v/v)，并且优选地至少为16％，

(ii)将至少一个表达盒或删除盒整合到步骤(i)中的酵母的基因组中，所述至少一个盒选自以下组成的组：

a.编码使用NADH；H+而非NADPH；H+作为优先辅因子的突变木糖还原酶的树干毕赤酵母XRm基因/酿酒酵母启动子和终止子的开放阅读框(ORF)型的结合，所述盒上游和下游侧邻有允许其靶向整合到所述基因组中的重组区域，

b.编码木糖醇脱氢酶的树干毕赤酵母XDH基因/酿酒酵母启动子和终止子的开放阅读框(ORF)型的结合，所述盒上游和下游侧邻有允许其靶向整合到所述基因组中的重组区域，

c.编码木酮糖激酶的酿酒酵母XKS1基因/酿酒酵母启动子和终止子的开放阅读框(ORF)型的结合，所述盒上游和下游侧邻有允许其靶向整合到所述基因组中的重组区域，

(iii)通过将戊糖磷酸途径的非氧化部分中的各步骤的至少一种基因置于在醇发酵过程中强表达的糖酵解基因的启动子的控制下而诱导其表达，以及

(iv)删除编码醛糖脱氢酶的酿酒酵母GRE3基因的开放阅读框(ORF)的至少两个拷贝。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述XRm是编码K270M XRm的基因。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述XRm是编码K270R XRm的基因。

4.根据权利要求1至3中的一项所述的方法，其特征在于所述酿酒酵母启动子选自由ADH1、ADH2、PGK1、TDH3、PDC2和GAL1/10组成的组，优选地是ADH1，并且特征在于所述酿酒酵母终止子由CYC1的终止子或由所述修饰基因自身的终止子构成。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于该方法包括随后的定向进化步骤，其包括以下顺序步骤：使所获得的酵母进行

(i)诱变，

(ii)在限制O₂条件下在包含所述至少一种戊糖的培养基中在循环培养中生长，以及

(iii)在包含甘油作为唯一碳源的固体培养基上通过有氧生长进行选择，从而获得所述酵母的非呼吸缺陷型突变体，其在包含所述至少一种戊糖的培养基存在的情况下表现出有氧生长。

6.以CNCM No.I-4295进行保藏的酿酒酵母酵母菌株EG3。

7.以CNCM No.I-4294进行保藏的酿酒酵母酵母菌株EG2，所述菌株产生于EG3菌株的定向进化。

8.以CNCM No.I-4293进行保藏的酿酒酵母酵母菌株EG1，所述菌株产生于EG3菌株的定向进化。

9.以CNCM No.I-4450进行保藏的酿酒酵母酵母菌株EG9。

10.一种通过根据权利要求1至5中任一项所述的方法而获得的酵母菌株，其特征在于其不含抗生素抗性标记。

11.一种用于从包含至少一种戊糖的培养基生产乙醇的方法，其通过根据权利要求7至10中任一项所述的酵母或通过根据权利要求1至5中任一项所述的方法而获得的酵母的发酵来实现。

12.根据前述权利要求中所述的方法，其特征在于其包括在己糖聚合物和能够对其进行水解的至少一种酶存在的情况下进行同步糖化发酵(SSF)的步骤，所述己糖主要由葡萄糖组成。

13.根据权利要求11和12中任一项所述的方法，其特征在于所述至少一种戊糖是木糖。

14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其特征在于所述培养基选自由木质素水解物、纤维素水解物、半纤维素水解物和糊精水解物组成的组。

15.根据前述权利要求中所述的方法，其与权利要求12进行组合，其特征在于所述己糖(主要为葡萄糖)的平均释放速度约为2.8至5.6g/L/h，己糖(主要为葡萄糖)细胞外浓度为零。