[发明专利]一种鉴定抗体敏感性和克隆细胞株的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及抗体技术领域。更具体地讲，本发明涉及一种抗体敏感性的鉴定方法，和抗体制备过程中，分泌目标抗体的阳性克隆细胞株的鉴定方法。

背景技术

抗体是B细胞增殖分化为浆细胞所分泌的一类具有免疫功能的球蛋白，存在于体液中并介导体液免疫。抗体能与相应抗原(如病原体)特异性结合，在其他免疫分子和细胞的参与下发挥免疫效应。根据性质不同可将抗体分为单克隆抗体(以下简称单抗)和多克隆抗体(以下简称多抗)两种。单抗具有理化性状高度均一、生物活性单一、抗原结合特异性强、易于控制质量等优点，现已广泛应用于生物学和医学研究领域。单抗可作为亲合层析的配体、生物治疗的导向物、免疫抑制剂、研究工作中的探针等，广泛应用与研究、疾病的治疗和诊断。在临床检测方面主要用于诊断各类病原体，检测肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原和检测淋巴细胞表面标志和测定机体微量成分。

在临床诊断中，单抗的质量直接决定了检测结果准确性，而单抗对其抗原的敏感性是反映单抗质量的重要指标。目前临床和科研中针对抗体敏感性的鉴定方法主要有ELISA(酶联免疫吸附试验)、Western-blot(免疫印迹)试验、免疫荧光试验，但这些方法均存在一定的不足。

ELISA和Western-blot检测试验中所使用的抗原蛋白为重组蛋白或通过裂解细胞获得的变性蛋白复合物，与天然构象蛋白都存在一定差异，因此这些实验结果反映出的仅是重组或变性蛋白与单抗的敏感性，而不能准确反映单抗与天然构象蛋白敏感性。尤其是如果该单抗所结合的抗原决定簇为构象表位，由于蛋白变性后空间结构被破坏，单抗则不能与此变性蛋白结合，采用此变性蛋白抗原检测结果就得到假阴性的错误结果。

免疫荧光试验包括直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验，其中间接免疫荧光试验需要借助于二抗来完成，这两个试验虽然能反映单抗与天然构象蛋白结合的能力，但由于其操作时间较长、操作步骤较为繁琐，同时需要高昂的试验设备，如荧光显微镜、流式细胞仪。

CN1660907A公开了单抗的三种鉴定方法，包括间接免疫荧光法、斑点免疫印迹法和金标记免疫电镜法，其中间接免疫荧光法和金标记免疫电镜法均需要高昂的设备配合进行结果的判断，斑点免疫印迹法借助硝酸纤维素膜作为固相载体进行抗原-抗体反应，需要通过获得细胞膜蛋白裂解液进行吸附，由于细胞膜蛋白裂解液中的蛋白发生了变性，因此鉴定结果不能反应单抗与天然构象蛋白的敏感性。

CN1718588A公开了一种单抗用于恶性肿瘤检测的方法，它是通过ELISA技术和免疫印迹技术实现的，ELISA试验技术是以重组蛋白作为抗原进行检测，免疫印迹试验技术是以变性的蛋白作为抗原进行的检测，两种试验技术均无法真实反映出单抗与天然构象蛋白的敏感性。

CN101891806A公开了一种单抗质量的筛选方法，是使用间接免疫荧光技术来实现的，间接免疫荧光试验的判定需要昂贵的荧光显微镜，一般的小型临床和科研机构的经济承受能力有限，这种方法不利于普及。

此外，在单抗的制备过程中，人们需要对抗体阳性克隆细胞株进行筛选，获得能分泌高敏感性抗体的克隆细胞株。目前人们大多采用ELISA方法进行阳性克隆筛选。该方法一般使用重组蛋白作为抗原，筛选出的单抗往往并不适用于天然构象蛋白的结合反应，造成筛选失败，浪费人力物力。

CN1693461A公开了单抗制备过程中阳性克隆细胞株的筛选方法，是使用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)进行的，这种方法一般是使用重组蛋白作为抗原进行筛选，但是由于重组蛋白与天然构象蛋白有一定差异，因此通过ELISA筛选出的阳性克隆细胞株并不能真实反映单抗与天然构象蛋白的敏感性。

可见，现有的抗体和抗体阳性克隆细胞株的筛选方法，多数是通过抗体与重组蛋白或变性蛋白的结合水平反映抗体的敏感性。而在医学检验领域，多要利用抗体与天然构象蛋白的特异性结合力，为了准确快捷筛选出与天然构象蛋白结合能力强的单抗，需要一种新的试验技术来判断单抗的与天然构象蛋白的结合水平。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明利用细胞，特别是细胞表面的天然构象的蛋白来鉴定抗体敏感性或鉴定阳性克隆细胞株。

本发明一方面提供了一种鉴定抗体敏感性的方法，包括如下步骤：

获取固相载体、细胞和抗体；

抗体吸附于固相载体；

细胞与吸附在固相载体的抗体孵育，保留细胞中与抗体结合的细胞；

对与抗体结合的细胞进行染色和细胞计数；

根据细胞计数结果鉴定抗体的敏感性。