[发明专利]一种肿瘤特异性γδT淋巴细胞的体外扩增方法

说明书

技术领域

本发明属于医学领域，具体地说，涉及一种肿瘤特异性γδT淋巴细胞的体外扩增方法。

背景技术

T细胞表面具有能特异地识别抗原的结构，称为T细胞抗原受体(TCR)。根据TCR的不同类型，T细胞可分为αβT细胞和γδT细胞。

αβT细胞主要参与获得性免疫过程，通过MHC限制性识别肿瘤细胞。然而，肿瘤细胞能通过MHC突变、削弱抗原递呈、诱导产生抑制性免疫细胞等免疫逃避机制，阻断抗原识别过程。

γδT细胞被认为是介于获得性与天然免疫之间的特殊免疫细胞类型(ChemImmunol Allergy.2005，86：151-183.)，占CD3+T细胞的1％～5％，大部分γδT细胞不表达CD4、CD8分子，有特异性识别抗原功能而无MHC限制，并在机体抗感染和自身免疫疾病及抗肿瘤等过程中起重要作用(Nat Rev Immune.2002，2：336-345)。活化的γδT细胞具有多种细胞功能，它既可以直接杀死特殊细胞，表现出Tc活性；又可分泌细胞因子，协调免疫反应，表现出Th活性。由于γδT细胞灵活的细胞功能和独特的抗原识别谱，它在机体的免疫应答和免疫监视中起着不可或缺的作用。

由于γδT细胞在人体内比例低、数量有限，鉴于其强大的肿瘤杀伤活性，寻找一种简便、特异地激发和扩增γδT细胞的方法，无疑将有助于对这群细胞的生物学特性和功能的研究，以及在肿瘤过继免疫疗法中的可能性运用。并且，应用体外诱导扩增的抗原特异性免疫细胞治疗恶性肿瘤已成为一种有效的临床免疫治疗方法(TRENDS in Immunology.2001，22(9)：516-523.)。体外扩增的γδT细胞也已应用于临床试治(Blood.2003，102：200-206；Immunol Res.2009，45(1)：85-95；ExpMol Pathol.2004，76(2)：117-121；Cancer Res.2010，70：10024-10027)。

目前有许多体外培养γδT细胞方法的报道，包括用抗CD3抗体、IL-2和IL-4(Leukemia.2011，doi：10.1038)、抗TCRγδ和IL-2(中国免疫学杂志.2011，739-743)、非肽磷酸抗原和IL-2(Blood.2003，102：200-206)等。虽然细胞培养和扩增方法不断的改进和完善，但国内外对γδT细胞过继免疫治疗的研究大多以健康人γδT细胞为研究对象，所以扩增出来的γδT细胞特异性不高，降低了其肿瘤杀伤效应，导致以γδT细胞为基础的免疫治疗受到了一定的限制。因此，寻找新的高效的自体γδT细胞扩增方法以提高其用于过继免疫治疗的效率，显得尤为重要。

发明内容

本申请的发明人利用白血病患者自体的单核细胞组分CD4-CD8-PBMCs为：“种子细胞”，通过与灭活的自体白血病细胞、重组人白介素2(rhIL-2)和植物凝集素(PHA)共同培养，刺激诱导具有真正肿瘤杀伤作用的γδT淋巴细胞得以选择性扩增，从而获得具有个体化效应特征的肿瘤特异性γδT淋巴细胞。

本发明的目的是提供一种肿瘤特异性γδT淋巴细胞的体外扩增方法。

本发明的肿瘤特异性γδT淋巴细胞的体外扩增方法包括以下步骤：

(1)由初发白血病患者外周血中分离得到白血病细胞并灭活；

(2)由缓解的白血病患者的外周血中分离得到单核细胞组分CD4-CD8-PBMCs；

(3)在重组人白介素2(rhIL-2)和植物凝集素(PHA)存在下，将步骤(1)中得到的灭活的白血病细胞与步骤(2)中得到的CD4-CD8-PBMCs共同培养，扩增肿瘤特异性γδT淋巴细胞。

根据本发明的优选实施例，所述步骤(1)包括将白血病细胞经放射性核素钴辐照灭活的步骤。

根据本发明的优选实施例，所述步骤(3)中培养的条件为37℃和5％CO₂。

本发明具有如下有益效果：

(1)直接将灭活的自体白血病细胞与γδT淋巴细胞相接触培养，能够免去繁琐的白血病相关抗原的筛选步骤，是一种简洁有效的方法。

(2)能够产生具有个体化效应特征的肿瘤特异性γδT淋巴细胞，可作为一种有效的白血病治疗方案。