[发明专利]一种细菌及选育方法和其生产纤维素酶的方法

权利要求书

1.一种细菌，其特征是它于2011年6月29号保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为CGMCC No. 5022，命名为潮湿纤维单胞菌NJ0807，分类命名为潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda），该菌的16S rDNA序列在GenBank登录号为HM034815。

2.一种如权利要求1所述的潮湿纤维单胞菌的选育方法，其特征是所述方法包括以下步骤：

步骤a,将牛瘤胃液中的微生物于以纤维素为唯一碳源的富集培养基中，30℃条件下180rpm富集培养摇瓶培养3~5天；

步骤b,对富集培养的菌液稀释后用细胞计数板计算菌液的浓度，用无菌生理盐水对菌悬液进行稀释，采用十倍稀释法对富集培养的菌液梯度稀释到10^-8，分别取10^-6、10^-7和10^-8三个梯度的菌悬液0.1mL涂布到筛选培养基中，30℃培养2~10天；

步骤c,挑取具有纤维素水解圈的微生物在液体培养基中30℃条件下180rpm培养2~3天，将发酵液在4℃以12000 rpm离心10 min，测定上清液的纤维素酶活力，筛选出酶活力最大的菌株进行复筛，复筛后得到潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）NJ0807。

3.根据权利要求2所述的潮湿纤维单胞菌的选育方法，其特征是步骤a中所述的富集培养基组成为：0.5% CMC，0.5%滤纸，0.2% NaNO₃，0.1% K₂HPO₄，0.05% KCl，0.05% MgSO₄·7H₂O，0.0001% FeSO₄，pH自然。

4.根据权利要求2所述的潮湿纤维单胞菌的选育方法，其特征是步骤b中所述的筛选培养基组成为：0.5% CMC，0.2% NaNO₃，0.1% K₂HPO₄，0.05% KCl，0.05% MgSO₄·7H₂O，0.0001% FeSO₄，添加终浓度为1.6%的琼脂。

5.根据权利要求2所述的潮湿纤维单胞菌的选育方法，其特征是步骤c中所述的液体培养基组成为：1%蛋白胨，0.5% CMC，0.5% NaCl，0.1% K₂HPO₄，0.05% MgSO₄，0.03% CaCl₂，0.2% (NH₄)₂SO₄，调节pH为7.2。

6.一种用权利要求1所述的潮湿纤维单胞菌生产纤维素酶的方法，其特征是所述方法包括以下步骤：

步骤如下：

(1)通过将菌株潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）NJ0807先在LB液体培养基中进行种子液培养，接种后在30 ℃培养24小时，按2%~10%接种量接种到下列培养基：蛋白胨或酵母膏0.5%~1%，蔗糖0.2%~1%，CMC 0.1~1%或微晶纤维素0.1%~0.5%，NaCl 0.1%~0.5%，K₂HPO₄ 0.1%~0.2%，MgSO₄·7H₂O 0.01%~0.05%，培养基的初始pH为6.5~8.5；

(2)在500 mL三角烧瓶中装有200 mL培养基进行摇瓶发酵，24~30 ℃培养2~3天;

(3)将发酵液在4 ℃条件下12000 rpm离心30分钟出去菌体细胞，上清液使用75%冷乙醇沉淀，加入无水乙醇时边搅拌边缓慢加入，溶液放置半小时后以12000 rpm离心10分钟，沉淀溶解在等体积的20 mM Tris-HCl（pH 8.8）缓冲液中得到纤维素酶粗酶液。