[发明专利]发酵法制取乙醛脱氢酶的一种方法

权利要求书

1.一种发酵法制取乙醛脱氢酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)发酵培养：以啤酒酵母LY01为出发菌株，将培养好的种子液按一定的接种量接入发酵培养基中，在一定的温度下进行发酵培养；

2)破壁处理：将培养成熟的啤酒酵母离心，菌体用无菌水洗涤1～3次，之后用磷酸缓冲液(pH7.0～7.5)制成菌悬液，菌体的质量比浓度为10％～20％；将上述菌悬液置于4～6℃，用低温高压细胞破碎仪破碎；

3)高速离心：将细胞破碎后，以4℃、5000～10000r/min离心5～15min，收集上清液，即粗酶液；

4)硫酸铵分级沉淀：将粗酶液先用20～40％饱和度的硫酸铵沉淀，留取上清液，再将其上清液用80～90％饱和度的硫酸铵沉淀，去掉上清液，将沉淀物用0.01～0.2mol/L磷酸缓冲液(pH7.0～7.5)溶解；

5)双水相萃取：双水相体系中含有粗酶液、PEG、(NH₄)₂SO₄，体系混匀后于4℃、5000～10000r/min离心5～15min，乙醛脱氢酶集中在上相(PEG相)；

6)膜过滤：将PEG相进行超滤，除去PEG、盐离子，实现浓缩，同时回收PEG；

7)真空冷冻干燥：将超滤浓缩液进行冷冻干燥、粉碎，即得纯度大于40％的乙醛脱氢酶。

2.根据权利要求1所述的发酵法制取乙醛脱氢酶的一种方法，其特征在于，步骤1)所述的啤酒酵母LY01发酵培养基组分为：按照重量比，蛋白胨0.5％～1.5％，酵母膏0.3％～1.2％，麦芽汁0.3％～1.2％，水补齐，pH值5.0～6.0，121℃，灭菌20min～30min。

3.根据权利要求1所述的发酵法制取乙醛脱氢酶的一种方法，其特征在于，步骤1)所述的发酵培养接种量为2％～8％，培养温度为28℃～32℃，pH值5.0～6.0，培养15h～24h。

4.根据权利要求1所述的发酵法制取乙醛脱氢酶的一种方法，其特征在于，步骤2)所述的培养成熟的啤酒酵母在4℃下，在5000r/min～10000r/min下高速离心5min～15min。

5.根据权利要求1所述的发酵法制取乙醛脱氢酶的一种方法，其特征在于，步骤2)所述的菌体悬液的制备为：用浓度为0.01mol/L～0.2mol/L、pH值为7.0～7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，配制成质量比浓度为10％～20％的菌体悬液。

6.根据权利要求1所述的发酵法制取乙醛脱氢酶的一种方法，其特征在于，步骤2)所述的啤酒酵母的破壁用低温高压细胞破碎仪破碎，菌悬液置于4℃～6℃，压力为1000～2000bar，经15s～25s一次性破碎。

7.根据权利要求1所述的发酵法制取乙醛脱氢酶的一种方法，其特征在于，步骤4)所述的硫酸铵分级沉淀所用硫酸铵饱和度分别为20％～40％、80～90％。

8.根据权利要求1所述的发酵法制取乙醛脱氢酶的一种方法，其特征在于，步骤5)所述的双水相体系中含有10％的粗酶液，10％～12％PEG20000和14％～16％(NH₄)₂SO₄。

9.根据权利要求1所述的发酵法制取乙醛脱氢酶的一种方法，其特征在于，步骤6)所述的超滤浓缩用截留分子量为3万的滤膜进行。