[发明专利]荷包猪SLA-3基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及我国特色品种荷包猪SLA-3等位基因cDNA的扩增、序列测定和分析；SLA-3功能基因分子进化图谱的绘制，荷包猪SLA-3-HB基因特征可用于荷包猪品系鉴别，该分子进化树可用于荷包猪的优势杂交育种及计算等位基因之间的遗传距离(即氨基酸位点变异率)。

背景技术

荷包猪属于东北民猪的一个小型类群，分布于辽西交通不便的山区一带，因外形酷似“荷包”而得名。该品种猪长期自繁自育，自然进化，已有300多年历史；该品种猪野生性强，具有良好的抗病能力；另外该品种猪肌间脂高，肌纤维细密，大理石花纹明显，而且肉质鲜美，味感香浓，俗有“北方香猪”之称。1987年被农业部列为国家一级保护猪种，2002年被列入《国家畜禽遗传资源保护名录》，2006年被确定为《国家级畜禽遗传资源保护品种》，是东北地区唯一得到国家保护的猪种。由于荷包猪还没有开发出利用市场，其保种目前完全依靠国家投入，成本昂贵，保种压力非常大。为了维持荷包猪数量的稳定，除了自繁自育外，每年要从一些山区农户收购一些散落的荷包猪。目前，主要依靠外形特征进行鉴别，而缺乏对其更加科学的的品种鉴别；另外，为了促进荷包猪的市场开发，也需要加快科学的育种。

本申请的发明人通过长期对荷包猪种质资源的调查研究，考虑到该品种独特的性能和地位，推测其在重要功能基因的分子进化上具有独特性。猪的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)，又称之为猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen，SLA)，其中SLA-I是一类重要的功能基因。Piontkivska等(2003)报道，脊椎动物的MHC分子代表物种的进化特征，据此推测猪MHC类分子重要功能基因SLA-I类分子等位基因有可能反映荷包猪的分子进化背景。SLA-I类分子据前述报道共有3个功能基因，分别是SLA-1，SLA-2和SLA-3。其中，SLA-3基因相对于SLA-1和SLA-2比较保守，但也呈现一定的多态性，即特殊的品系，其SLA-3基因具有独特的分子特征，而且该特征从一定程度上可以反应该品系猪品系差异。基于此，本申请的发明人拟从荷包猪SLA-I另外一功能基因SLA-3入手，针对性地研发准确可靠的品种鉴别方法，分析其基因的分子进化特征，为荷包猪品系优化和培育新品种提供指导性的数据。

发明内容

本发明的目的之一在于提供荷包猪SLA-3基因序列，发明人通过设计特异性引物，经RT-PCR扩增荷包猪SLA-3基因cDNA，再克隆至pMD-18T载体，然后测序。结果显示，从多个个体中克隆并归类为2类荷包猪SLA-3等位基因，即SLA-3-HB 01～02，其碱基序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

本申请的发明人利用RT-PCR扩增得到上述荷包猪SLA-3等位基因，扩增所用的引物序列是：

上游引物pM-3F1：5’-GGCTGAGGATCATGGGGCCCCG-3’(SEQ ID NO：3)；

下游引物pM-3R2：5’-GAACCCTGCCTTTGGAACTGTG-3’(SEQ ID NO：4)；

扩增PCR程序为：

94℃5min；

94℃45s，64℃30s，72℃1min，3循环；

94℃45s，62℃30s，72℃1min，3循环；

94℃45s，60℃30s，72℃1min，28循环；

72℃10min。

本发明的另一目的是提供用于荷包猪品种鉴别及指导遗传育种的方法。基于上述克隆得到的荷包猪SLA-3基因的2个等位基因序列，发明人调集DDBJ/EMBL/GenBank上除荷包猪外其他43个SLA-3等位基因，利用Gentyx 9.0(Software Development co.，Ltd)推导基因的氨基酸序列、DNAMAN Version5.2.2(Lynnon Biosoft)对SLA-3各等位基因进行序列对比，最后通过Mega5(Mega software Co.，Ltd)的neighbor-joining法绘制各基因的分子进化图谱。

发明人通过分析荷包猪SLA-3-HB的基因分子特征，发现荷包猪SLA-3-HB 01～02基因对应的特征性氨基酸位点在其编码区的7位(V)、56位(W)、74位(Q)、137位(F)、237位(S)、320位(M)、357位(Q)。