[发明专利]新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的分组纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种新生大鼠嗅球鞘细胞的分组纯化方法，其应用于新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的纯化过程。

背景技术

近年来嗅鞘细胞(olfactory ensheat hing cells，OECs)已成为脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)修复理论及应用基础研究领域的热点，被认为是在组织细胞移植修复SCI研究中极具应用前景的移植材料。O ECs作为移植材料，其需求量大，纯度、活性要求高，因此必须通过体外培养、纯化获得。用于O ECs纯化细胞的方法较多，各有优缺点，在OECs细胞移植修复SCI的研究中，究竟采取何种纯化方法目前尚无定论，同时关于纯化效率比较的研究文献不多。

发明内容

本发明探讨新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的体外培养和纯化方法，以为研究脊髓损伤后神经再生获得丰富OECs来源奠定基础。

所述的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的纯化方法如下：

S1：OECs的取材：选用新生1～2d的SD大鼠12只，用75％的酒精搽洗口鼻，浸入75％的酒精中2min以消毒皮肤，在超净台内显露两侧嗅球，并将之取下(尽量保持其完整性)，置于盛有PBS平衡盐溶液的4℃冰浴的培养皿中，在手术显微镜下用显微外科剪仔细去除嗅球表面的毛细血管和软脑膜。

S2：OECs的分离：将位于嗅球最外层的嗅神经层的嗅小球层以及少量连接的嗅神经轻轻剥下，用PBS液冲洗2遍，剪碎组织块，用浓度为0.125％的胰蛋白酶消化液在37℃下消化15min，经胰酶消化的组织小块移入生长培养液(20％小牛血清的DM EM/F212)中，静置10min，以中和胰酶作用。离心(800r/min，3min)去除上清液，吸取管底的组织小块，生长培养液清洗2次(动作要轻，尽量不使粘连的组织小块分开)。将组织小块移入2ml的生长培养液中，再用火焰抛光后的Pasteur移液管反复吹打组织块15～20次，使之形成细胞悬液。取一滴细胞悬液滴于细胞计数板计数，用生长培养液调整细胞浓度为5×105/ml。

S3：OECs分组纯化：12只大鼠取材后均分为正常对照组、免疫吸附组、化学药物组和差速贴壁组。

S4：形态学观察：将不同培养时间的OECs于倒置相差显微镜(Olympus CK40型)下进行形态观察，观察其形态及结构的变化，并进行比较。

S5：OECs纯度检测：各组OECs培养14d后进行的纯度检测。采用GFAP免疫酶细胞染色：DAB显色，苏木素复染，倒置显微镜下观察，随机选10个视野(0.45mm2)并计数GFA P阳性细胞的百分率。

本发明通过不同的的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的纯化方法实验，结果显示体外培养的新生大鼠嗅球OECs主要为双极或三级细胞，其突起细长。未经纯化的OECs则成纤维细胞生长迅速而占优势，三种纯化方法均能使接种14d后的OECs纯度均值大于75％。p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法的纯化率均值略高于差速贴壁法。故新生大鼠嗅球OECS的原代培养中细胞纯化是必要的；在脊髓损伤再生研究中，较之p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法，差速贴壁法是一种简单、经济、实用的OECs纯化方法。

附图说明

通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中：

图1所示为本发明的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的纯化方法的一个实施例的步骤流程图。

具体实施方式

如图1所示的本发明的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的纯化方法的一个实施例的步骤流程图，所述实施例中所使用的材料如下：

新生1～2d的SD大鼠，购于苏州大学医学院实验动物中心；DM EM/F212培养基购于In2vit rogen公司，胰蛋白酶、Forskolin、牛垂体提取液(B PE)、阿糖胞苷(Ara c)、多聚赖氨酸购于Sigma公司，小牛血清购于杭州四季青公司。胶质原纤维酸性蛋白GFA P抗体、低亲和性神经营养因子受体p75抗体、生物素化山羊抗兔IgG，偶联辣根过氧化物酶(HRP)的SABC购于武汉博士德公司。

所述的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的纯化方法如下：

S1：OECs的取材：选用新生1～2d的SD大鼠12只，用75％的酒精搽洗口鼻，浸入75％的酒精中2min以消毒皮肤，在超净台内显露两侧嗅球，并将之取下(尽量保持其完整性)，置于盛有PBS平衡盐溶液的4℃冰浴的培养皿中，在手术显微镜下用显微外科剪仔细去除嗅球表面的毛细血管和软脑膜。