[发明专利]一种用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法及其制品

说明书

技术领域

本发明涉及一种疫苗的制备方法及其制品，更具体地说涉及一种用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活苗的方法及其制品，属于生物技术领域。

背景技术

鸭出血性卵巢炎（Duck Hemorrhagic Ovaritis，DHO）是一种新近流行的、急性、高度接触性鸭传染病，其病原为鸭出血性卵巢炎病毒（Duck Hemorrhagic Ovaritis Virus，DHOV），在病毒分类上属于黄病毒科的成员。该病毒感染不同日龄鸭，产蛋鸭主要表现采食量急剧下降，产蛋率急剧下降，部分鸭出现瘫痪现象。剖解病变主要表现为卵巢出血，卵泡变形、变性，卵巢、卵黄、睾丸、输卵管和输精管萎缩，肝脏表面有粟粒状结节。商品肉鸭表现为死淘率增加。

新近科学研究情况：在病毒分类地位的研究中，曹贞贞、张存等人通过对鸭出血性卵巢炎病毒与黄病毒属恩塔亚病毒群（Ntay a virus group，NTAV群）和乙型脑炎病毒群（Japanese encepHalitis virus group，JEV群）中选NS1序列已知的病毒进行序列同源性分析和进化分析，发现该病毒与黄病毒科黄病毒属的巴格扎病毒的遗传距离位于病毒分类学种的水平。苏敬良、万春和、施少华等人的研究也表明分离获得的引起种（蛋）鸭产蛋骤降新病毒的核苷酸序列第9～777位与坦布苏病毒（TMUV）的同源性最高，为88.7％；遗传进化分析表明WR株病毒与坦布苏病毒、圣路易斯脑炎病毒（SLEV）、以色列火鸡脑膜炎病毒（ITV）、恩塔亚病毒（NTAV）具有相似的祖先。在诊断方面，曹贞贞、万春和、苏敬良、滕巧泱等人报道可以采用临床症状、大体及组织病理变化、PCR扩增和病毒分离等方法确诊该病。

该病的流行情况：2010年4月，自中国浙江首先发现以产蛋鸭产蛋量急剧下降为主要特征的疾病以来，先后在江苏、山东、河北、北京等省市发生类似的疾病。鸭出血性卵巢炎已经成为近期危害中国养鸭业的主要疫病之一。各种蛋鸭、樱桃谷种鸭和台湾白改种鸭均有发生，但主要见于开产蛋鸭。受染鸭群几乎100%发病，死亡率为5%～30%不等，蛋鸭产蛋率由80%以上下降至10%~30%甚至10%以下，严重者停产，虽然产蛋率可逐渐恢复，但从发病至恢复正常，约需1~2月；种鸭发病后种蛋的受精率和孵化率降低；商品肉鸭感染后死淘率明显增加。因此，该病给养鸭业带来巨大的经济损失，这使得养鸭业一度陷入绝境。

疾病的防控：目前，鸭出血性卵巢炎发生后，养殖户通常采用的控制措施是药物防治，大剂量使用各种抗菌素和抗病毒药，但往往无济于事，在部分鸭场甚至出现药物中毒的现象进一步增加了疫病的严重性。专家推荐的防治该病有效措施是注射疫苗，但目前尚未找到较好的疫苗株、大规模和高效价培养病毒的细胞系，疫苗评价模型尚未建立，制约着目前疫苗的开发。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷提供一种用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法及其产品。

本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。

一种用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，所述细胞系选自仓鼠肾细胞系或非洲绿猴肾细胞系。

上述方法，它包括如下步骤：

（1）选育毒株：将鸭出血性卵巢炎病毒鸭胚适应株在细胞系中连续传代培养3次，取传代适应毒株利用蚀斑纯化技术对其连续纯化培养三次，选取在仓鼠肾细胞系或非洲绿猴肾细胞系中培养效价高、免疫原性好的毒株作为候选病毒株；

（2）建立毒种种子批：将步骤（1）所得候选株病毒接种至细胞系中，传代培养至第15代，取第5～15代作为毒种种子批；

（3）制备细胞毒液：弃去形成良好单层细胞的细胞生长液，接种步骤（2）所得毒种种子批，吸附0.5～1h后，加入细胞维持液，继续培养，48～120h后细胞病变（CPE）达到80%以上时收获细胞毒液，该细胞毒液病毒含量≥10^6.5 TCID₅₀/1ml；

（4）灭活病毒：取步骤（3）所得细胞毒液冻融两次后，加入细胞毒液总量（V/V）0.1～0.2%的灭活剂，在37℃下振荡灭活16～24h；

（5）洗涤与浓缩细胞毒液：将步骤（4）所得灭活好的细胞毒液浓缩至原来体积的1/2，然后用等量pH值为7.0～7.2的PBS溶液洗涤，再进行浓缩，如此反复2～3遍，随后进行最后一次浓缩，将细胞毒液浓缩为原来体积的1/5～1/10，细胞毒液蛋白含量应不大于400ug/ml；