[发明专利]一种用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法及其制品

权利要求书

1.一种用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述细胞系选自仓鼠肾细胞系或非洲绿猴肾细胞系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，它包括如下步骤：

（1）选育毒株：将鸭出血性卵巢炎病毒鸭胚适应株在细胞系中连续传代培养3次，取传代适应毒株利用蚀斑纯化技术对其连续纯化培养三次，选取在仓鼠肾细胞系或非洲绿猴肾细胞系中培养效价高、免疫原性好的毒株作为候选病毒株；

（2）建立毒种种子批：将步骤（1）所得候选株病毒接种至细胞系中，传代培养至第15代，取第5～15代作为毒种种子批；

（3）制备细胞毒液：弃去形成良好单层细胞的细胞生长液，接种步骤（2）所得毒种种子批，吸附0.5～1h后，加入细胞维持液，继续培养，48～120h后细胞病变CPE达到80%以上时收获细胞毒液，该细胞毒液病毒含量≥10^6.5 TCID₅₀/1ml；

（4）灭活病毒：取步骤（3）所得细胞毒液冻融两次后，加入细胞毒液总量（V/V）0.1～0.2%的灭活剂，在37℃下振荡灭活16～24h；

（5）洗涤与浓缩细胞毒液：将步骤（4）所得灭活好的细胞毒液浓缩至原来体积的1/2，然后用等量pH值为7.0～7.2的PBS溶液洗涤，再进行浓缩，如此反复2～3遍，随后进行最后一次浓缩，将细胞毒液浓缩为原来体积的1/5～1/10，细胞毒液蛋白含量应不大于400ug/ml；

（6）乳化：向步骤（5）所得浓缩好的细胞毒液加入（V/V）4%～8%吐温80，搅拌均匀为水相，按照油相与水相的体积比1.5～3：1进行乳化，乳化后即得成品。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述蚀斑纯化技术为0.1%中性红蚀斑纯化技术。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞生长液的组成为：体积百分含量90%～92%的 DMEM液、8%～10%新生牛血清，pH值调整为7.2～7.4。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述接种的剂量为细胞生长液体积的0.3%～1.0%。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞维持液的组成为：体积百分含量95%～98% DMEM液、2%～5%新生牛血清，pH值调整为7.2～7.4。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述灭活剂为质量浓度37%的甲醛溶液。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述浓缩中其使用截留分子量50kd的密里博超滤膜包进行超滤浓缩。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述油相的制备方法为：在白油中按（V/V）4%～8%加入司班80，按（W/V）1%～2%加入硬脂酸铝，灭菌后即得油相。

10.一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗制品，其特征在于，它采用如权利要求1～9任一权利要求所述的方法制备而成。