[发明专利]一种杨树愈伤组织诱导方法及诱导培养基

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物的组织培养基，特别涉及杨树愈伤组织的诱导培养基及其在培养杨树花药愈伤组织中的应用，属于杨树的组织培养领域。

背景技术

北京杨(Populus beijingensis)为青杨和钻天杨的杂交后代，是新中国成立后林业界第一次用人工杂交育种方法育成的杨树新品种，其具有耐寒、喜水肥、树态美等特点，是优良的用材林、防护林、行道树和“四旁”绿化树种，深受群众喜爱。主要分布于中国的华北和西北等地区。

由于杨属植物是雌雄异株，自花授粉基本上是不可能实现的。通过常规的杂交育种获得纯合的株系需要很长的育种周期。为了获得纯合的杨树株系，研究者以往采用自花授粉或是回交的方法，但是这一育种过程需要的育种年限很长。通过花药培养则可以先获得目标株系的单倍体，后将之进行加倍成为双单倍体(doubled haploids，DHs)，这样就可显著缩短育种周期。此外，随着现代生物分子技术的迅速发展，植物单倍体及其产物已经在倍性育种、基因组测序、图谱构建和功能基因的发掘与鉴定等多方面成功应用并取得了很大的成果，单倍体植物材料及其产物为越来越多的研究者所青睐。

目前，植物单倍体的诱导途径包括花药和花粉培养、孤雌生殖、染色体消除等，其中花药培养是获得植物单倍体的一种较为有效的技术。愈伤组织培养是一种最常见的培养方式，除茎尖分生组织培养和一部分器官培养以外，其它几种植物组织培养形式最终都要经历愈伤组织才能产生植株。此外愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的材料来源。愈伤组织分为胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织，胚性愈伤组织易于再生芽，可发育成幼嫩的植株。

在离体条件下，用离体的方法培养花药，人为的改变小孢子的发育途径，使其配子体发育途径终止，转向孢子体发育，通过器官分化的途径，获得完整的单倍体植株，为人工大量生产单倍体提供了有效地手段。通过这一途径再生的单倍体植株，经过自发加倍或人工诱导加倍，获得纯和二倍体植株，从而为进一步的育种和遗传研究提供有用的材料。利用花药花粉诱导愈伤组织，愈伤组织分化培养获得单倍体进行育种是植物育种技术上的一项重大改革，它可以与目前所采用的杂交育种、人工诱变育种、远缘杂交等方法结合，用以克服这些方法中的不足，也可以直接用此方法创造新的类型。但是一直以来花药培养过程中存在愈伤组织诱导率低的问题，使得植物单倍体远远不能满足研究者们的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有的杨树花药培养过程中所存在的愈伤组织诱导率低的问题，提供一种新的杨树愈伤组织的诱导方法，本发明方法摸索并筛选到最适宜的杨树花药愈伤组织的诱导培养基及其培养条件，该方法可以在较短时间内形成大量优良的杨树愈伤组织，愈伤组织诱导率高，获得的愈伤组织的器官分化率高，可进行规模化、工厂化生产。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

本发明一方面提供一种优化的杨树花药愈伤组织诱导培养基，所述杨树花药愈伤组织诱导培养基是添加了0.5-1.5mg/L萘乙酸(NAA)、0.5-1.5mg/L 6-糠氨基嘌呤(KT)、20-40g/L蔗糖、4.5-6.5g/L琼脂的H培养基。

其中，所述NAA的浓度优选为0.5-1.0mg/L，进一步优选为1.0mg/L；所述KT的浓度优选为0.5-1.0mg/L，进一步优选为1.0mg/L；所述蔗糖的浓度优选为30g/L；所述琼脂的浓度优选为5.5g/L。

优选地，本发明所述杨树为北京杨(Populus beijingensis)。

本发明另一方面提供一种杨树愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤：

1)从消毒处理后杨树花序中取出花药，获得无菌花药外植体；

2)将无菌花药接种在所述的杨树花药愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，获得愈伤组织。

本发明中所述的杨树优选为北京杨(Populus beijingensis)。

为了达到更好的培育效果，当杨树花序的小孢子发育时期处于单核靠边期时，此时将其中的花药取出进行愈伤组织的诱导培养，能有效的提高愈伤组织的诱导培养率，诱导得到的愈伤组织生长速度快，呈黄色或褐色，表面粗糙，质地疏松易碎，具有较高的活力。其中，杨树小孢子发育时期可以通过观察花芽的形态和直径粗略判断小孢子的发育时期。较为有效的检测方法是染色观察小孢子的发育阶段，本发明通过醋酸洋红染色观察来确定小孢子的发育时期。

由于杨树花为柔荑花序，花芽表面的鳞片微被毡毛，步骤1)中所述消毒处理采用如下处理方式具有更好的无菌效果：