[发明专利]一种补体系统激活水平的ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学检测方法领域，具体涉及一种药物影响补体系统三条激活途径激活水平的ELISA检测方法。

背景技术

现有技术公开了补体系统包括30余种组分，广泛分布于人和脊椎动物的血清、组织液和细胞膜表面，是具有精密调控机制的蛋白质反应系统。补体不仅是机体固有免疫防御的重要组成部分，也是抗体发挥免疫效应的主要机制之一。研究显示，补体系统的正常活化可介导防御微生物感染和炎症应答，但是其非正常活化会导致机体的严重损伤。临床上观察补体的动态变化，对一些疾病的诊断、病因研究等有重要的意义。多种疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、免疫复合物引起的肾炎、急性肺损伤，缺血再灌注引发的组织损伤及同种异体器官移植排异反应等均涉及补体系统过度激活。建立快速和高效补体抑制剂筛选平台，对急、慢性炎性疾病的治疗有着重要的意义。

研究显示，多种微生物成分、抗原-抗体复合物以及其他外源性或内源性物质可循三条既独立又交叉的途径，即经典激活途径、替代激活途径和甘露糖激活，通过启动一系列丝氨酸蛋白酶的级联酶解反应而激活补体，所形成的活化产物具有调理吞噬、溶解细胞、介导炎症、调节免疫应答和清除免疫复合物等生物学功能。其中，补体成分C3是三条激活途径的共同节点，C3被激活后裂解成C3a和C3b两个片段，随后大片段C3b可以进一步裂解成C3c和C3d，其中较大片段C3c为较稳定的裂解产物，并且可以与激活物相连接。

现有补体系统检测手段主要是溶血试验和补体缺失血清试验，以及酶联免疫吸附测定实验。其中，溶血试验应用最为广泛。

溶血试验是目前最常用的检测方法。三条补体激活途径所介导的终产物均为膜攻击复合物，具有溶解能力，可以反映补体的功能，因此常采用补体溶血试验测定经典途径或替代途径的总补体活性。补体溶血反应是基于抗红细胞血清与红细胞结合后，遇到补体即可使红细胞发生溶血这一特点所建立的。具体方法是将抗红细胞抗体与红细胞结合，制成致敏红细胞，然后用致敏红细胞去检测补体活性。羊红细胞可以测定经典激活途径，兔红细胞可以测定替代激活途径。对补体系统中任何一级的抑制均可导致部分或全部激活级联反应受阻断，但溶血试验只能反映血清或体液中总的补体活性大小，无法准确定位药物作用靶点。此外，膜攻击复合物在进攻红细胞使其裂解时并非一一对应，即一个红细胞的裂解可能是由一个膜攻击复合物引起的，也可能是由多个膜攻击复合物引起的，因此，红细胞的裂解量并不能准确地反映补体系统的激活水平。目前，溶血试验无法对甘露糖途径的激活水平进行测定。

在补体缺失血清试验中，首先将一定浓度的药物与一定浓度补体混合使其恰好完全抑制补体溶血，再补充不同成分补体缺失血清，若药物作用部位恰好为这一缺失成分，则体系依然不溶血；反之，体系溶血。这一方法可用于确定药物在补体激活体系中的作用位点，但是补体缺失血清大多需自行制备，步骤繁琐复杂，且工作量大，研究速度缓慢。如果直接购买补体缺失血清，试剂昂贵。同时，这种方法无法研究药物对补体系统的非特异性作用或半溶血作用，存在一定缺陷。

ELISA是酶联免疫吸附测定试验的简称，它是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的相应抗体或抗原既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，使其通过反应结合在固相载体上。此时，固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

国外有文献报道，将ELISA方法应用于血清中补体水平的检测，该方法是针对经典途径、替代途径和甘露糖途径三条激活途径，分别用IgM、LPS和甘露糖三种激活物包被高吸附性酶标板，封板后加入含补体的血清，以地高辛连接的抗C3抗体为一抗，捕捉血清中的C3片段，以HRP连接的羊抗地高辛抗体为酶标检测抗体，建立检测补体水平的ELISA方法，并主要应用于患者体内补体水平的测定。

发明内容

本发明目的在于，基于ELISA原理，提供一种新的测定补体系统三条激活途径激活水平的方法，并用于补体抑制剂的高通量筛选。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：