[发明专利]一种早期预测肾移植术后急性细胞性排斥反应的方法

说明书

技术领域

本发明属于移植免疫检测领域，特别涉及一种早期预测肾移植术后急性细胞性排斥反应的方法。

背景技术

传统肾移植术后急性细胞性排斥反应的检测方法多从移植受者者血液、尿液直接进行ELISA检测，但由于移植受者服用免疫抑制剂致使免疫分子表达受到抑制，因此在血液、尿液表达量较低，从而导致免疫标记分子表达量在肾功能正常与急性排斥受者之间的差距较小，因而此类传统做法存在检测的免疫指标灵敏度低、特异度不高的现象。

发明内容

本发明的目的旨在克服现有移植免疫检测领域技术和功能上的缺陷与不足，针对移植免疫检测领域高灵敏度、高特异度的要求，提供一种预测肾移植术后急性细胞性排斥反应的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种早期预测肾移植术后急性细胞性排斥反应的方法，其特征在于，包括：体外刺激肾移植受者外周血淋巴细胞，增加免疫分子的表达以放大排斥反应信号，并提前预测急性细胞性排斥反应，

所述体外刺激是指PMA和离子霉素体外刺激，

所述排斥反应信号是指流式细胞术检测细胞培养上清液IL-2和IL-6的含量，

所述排斥反应信号还指流式细胞术检测细胞培养上清液TNF-α和IFN-γ的含量，

所述提前预测是指诊断急性细胞性排斥反应的时间要早于其临床诊断。

所述方法可提前3-5天预测急性细胞性排斥反应。

所述体外刺激时间为4-8h。

其特征在于：所述细胞培养液上清IL-2和IL-6的含量预测术后急性细胞性排斥反应的灵敏度为91.7％，特异度为95.6％。

所述细胞培养液上清TNF-α和IFN-γ的含量预测术后急性细胞性排斥反应的灵敏度为89.2％，特异度为93.23％。

所述细胞培养液上清IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的荧光强度值在急性排斥反应组均显著高于肾功能正常组。

所述的方法还包括以下步骤：

1)采集肾移植受者晨起空腹肝素抗凝外周静脉血5ml，800rpm，离心3min，取血浆0.2ml置入无菌0.5ml EP管中，剩余抗凝全血用PBS对倍稀释；

2)取3个无菌试管(容积5ml)，每个试管加入2ml淋巴细胞分离液，每个试管中加入3ml用PBS对倍稀释的抗凝全血(用滴管沿管壁缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面)，2000rpm，离心20min；

3)离心结束后，用毛细吸管插到云雾层，吸取单个核细胞，置入另一无菌短中管中(容积15ml)，加入5倍以上体积的PBS液，1500rpm，离心10min，洗涤细胞1次；

4)离心结束后弃上清，在细胞沉淀中加入红细胞裂解液4ml，静置5min，期间颠倒混匀1次，1000rpm，离心5min；

5)离心结束后弃上清，加入PBS液10ml，混匀，1000离心5min，洗涤细胞2次；

6)末次离心弃上清，加入含有10％胎牛血清的RPMI 1640液100μL，重悬细胞，取10μL细胞悬液加入无菌0.5mlEP管中，并加入90μL PBS液充分混匀，取10μL稀释后的细胞悬液与10μL 0.2％台盼兰染液充分混合，滴加至血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数；

7)细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色，计数200个淋巴细胞，计算出活细胞百分率，本试验方案要求活细胞百分率在95％以上；

8)

9)将淋巴细胞悬液浓度调整至5.56×10⁶/ml(要求调整后的细胞悬液体积大于270μL)；

10)取一块无菌96孔培养板，选择3个孔，一个孔为对照孔，另外两孔为试验孔，对照空中加入肾移植受者血浆10μL、淋巴细胞悬液90μL和10μL含有10％胎牛血清的RPMI 1640液，充分混匀，试验孔中加入肾移植受者血浆10μL、淋巴细胞悬液90μL、92μL含有10％胎牛血清的RPMI 1640液、4μL PMA(浓度0.1-1.0μg/ml)和4μL离子霉素(浓度20-100μg/ml)，充分混匀；

11)置入37℃、5％CO₂培养箱中，培养4-8h；

12)培养结束后，取细胞培养液，1000rpm，离心5min，离心结束，吸取上清置入0.5EP管中；