[发明专利]一种早期预测肾移植术后急性细胞性排斥反应的方法

权利要求书

1.一种早期预测肾移植术后急性细胞性排斥反应的方法，其特征在于，包括：体外刺激肾移植受者外周血淋巴细胞，增加免疫分子的表达以放大排斥反应信号，并提前预测急性细胞性排斥反应，

所述体外刺激是指PMA和离子霉素体外刺激，

所述排斥反应信号是指流式细胞术检测细胞培养上清液IL-2和IL-6的含量，

所述排斥反应信号还指流式细胞术检测细胞培养上清液TNF-α和IFN-γ的含量，

所述提前预测是指诊断急性细胞性排斥反应的时间要早于其临床诊断。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法可提前3-5天预测急性细胞性排斥反应。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述体外刺激时间为4-8h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞培养液上清IL-2和IL-6的含量预测术后急性细胞性排斥反应的灵敏度为91.7％，特异度为95.6％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞培养液上清TNF-α和IFN-γ的含量预测术后急性细胞性排斥反应的灵敏度为89.2％，特异度为93.23％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞培养液上清IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的荧光强度值在急性排斥反应组均显著高于肾功能正常组。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括以下步骤：

1)采集肾移植受者晨起空腹肝素抗凝外周静脉血5ml，800rpm，离心3min，取血浆0.2ml置入无菌0.5ml EP管中，剩余抗凝全血用PBS对倍稀释；

2)取3个无菌试管(容积5ml)，每个试管加入2ml淋巴细胞分离液，每个试管中加入3ml用PBS对倍稀释的抗凝全血(用滴管沿管壁缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面)，2000rpm，离心20min；

3)离心结束后，用毛细吸管插到云雾层，吸取单个核细胞，置入另一无菌短中试管中(容积15ml)，加入5倍以上体积的PBS液，1500rpm，离心10min，洗涤细胞1次；

4)离心结束后弃上清，在细胞沉淀中加入红细胞裂解液4ml，静置5min，期间颠倒混匀1次，1000rpm，离心5min；

5)离心结束后弃上清，加入PBS液10ml，混匀，1000离心5min，洗涤细胞2次；

6)末次离心弃上清，加入含有10％胎牛血清的RPMI 1640液100μL，重悬细胞，取10μL细胞悬液加入无菌0.5mlEP管中，并加入90μL PBS液充分混匀，取10μL稀释后的细胞悬液与10μL 0.2％台盼兰染液充分混合，滴加至血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数；

7)细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色，计数200个淋巴细胞，计算出活细胞百分率，本试验方案要求活细胞百分率在95％以上；

8)

9)将淋巴细胞悬液浓度调整至5.56×10⁶/ml(要求调整后的细胞悬液体积大于270μL)；

10)取一块无菌96孔培养板，选择3个孔，一个孔为对照孔，另外两孔为试验孔，对照空中加入肾移植受者血浆10μL、淋巴细胞悬液90μL和100μL含有10％胎牛血清的RPMI 1640液，充分混匀，试验孔中加入肾移植受者血浆10μL、淋巴细胞悬液90μL、92μL含有10％胎牛血清的RPMI 1640液、4μL PMA(浓度0.1-1.0μg/ml)和4μL离子霉素(浓度20-100μg/ml)，充分混匀；

11)置入37℃、5％CO₂培养箱中，培养4-8h；

12)培养结束后，取细胞培养液，1000rpm，离心5min，离心结束，吸取上清置入0.5EP管中；

13)取8支流式细胞仪专用试管，编号1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号和8号，1号、5号管为微球对照管，2号、6号管为抗体对照管，3号、7号管为阳性对照管，4号、8号管为待测样本管；

14)1号--8号管每管加入PBS液25μL，1号--4号管每管加入10μL包被IL-2的微球和20μL包被IL-6的微球，5号--8号管加入10μL包被TNF-α的微球和20μL包被IFN-γ的微球，3号管加入20μL阳性对照液体(含IL-2和IL-6)，7号管加入20μL阳性对照液体(含TNF-α和IFN-γ)，4号和8号管每管加入20μL待测样本(细胞培养液)，将所有试管混匀，4℃孵育25min；

15)孵育结束后，在所有试管中加入5ml PBS液，混匀，3400rpm离心6min，弃上清；

16)2号--4号管每管加入20μL二抗biotin(IL-2和IL-6)，6号--8号管每管加入20μL二抗Biotin(TNF-α和IFN-γ)，将所有试管混匀，4℃孵育25min；

17)孵育结束后，在所有试管中加入5ml PBS液，混匀，3400rpm离心6min，弃上清；

18)2号--4号管、6号--8号管每管加入20μL Avidin-PE，将所有试管混匀，4℃避光孵育25min；

19)孵育结束后，在所有试管中加入5ml PBS液，混匀，3400rpm离心6min，弃上清；

20)1号--8号管每管加入500μL PBS，立即进行流式细胞仪检测。