[发明专利]慢病毒介导的针对VEGF-C基因siRNA重组体970的构建及用途

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种RNAi慢病毒重组表达载体的构建及其肿瘤基因治疗中的应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference , RNAi)是通过实验手段向细胞内导入长的双链RNA或者细胞内源性产生一些短片段的双链RNA,这些短片段的双链RNA ( double stand RNA,dsRNA)可以通过促使特定基因的mRNA 降解来高效、特异地阻断体内特定基因的表达,使细胞出现特定基因缺失的表型,siRNA ( small interference RNA)就是这种短片段双链RNA分子,能够以序列同源互补的mRNA 为靶目标,降解特定的mRNA,最终使相应的基因沉默。由于这种现象发生在转录后,故又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。

RNAi技术不仅揭示了细胞内基因沉默的机制,而且有望成为后基因组时代基因功能分析的有力工具,是继酵母杂交系、DNA芯片、基因敲除、反义RNA 等技术之后的又一解读基因功能的有效研究手段,极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程。目前RNAi技术已经广泛用于基因功能研究和肿瘤基因治疗研究领域，其在肿瘤基因治疗上与基因替代、反义寡核苷酸治疗、细胞因子基因治疗等传统基因治疗方法相比，具有特异、高效和毒性小的特点，因此可用来对一些肿瘤进行基因治疗。

慢病毒载体（Lentiviral vector）较传统的质粒载体及逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，如①该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。该载体介导的基因改造后的肿瘤细胞可以产生大量的克隆，并且可以弥散分布于肿瘤实体；②不易诱发宿主免疫反应；③在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，为RNAi、cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径，也为基因功能的研究和肿瘤的基因治疗研究提供了更强有力的工具。

肿瘤的侵袭和转移是决定人类癌症恶性表型的关键因素，也是导致死亡的主要原因。肿瘤细胞通常是通过表达某一生长因子及其特异受体而组成其自身的自分泌信号通路来获得侵袭和迁移能力。有研究显示许多生长因子及其受体参与肿瘤的侵犯和转移过程，其中就包括VEGF-C/VEGFR-3淋巴管生长信号轴，如何中断这些生长因子及其受体组成的信号通路，目前已经成为研发抗癌新药物的主要策略之一。近年来，肿瘤的淋巴管生成备受学者关注，多种与淋巴管生成的因子被发现，其中血管内皮生长因子C(VEGF-C)被认为是目前发现的特异性淋巴管生成因子。VEGF-C可以激活其受体VEGFR-2和VEGFR-3而诱导肿瘤血管、淋巴管生成和促进肿瘤淋巴道转移，是一种重要的血管、淋巴管内皮细胞调节因子，与肿瘤的淋巴管生成、淋巴道扩散及淋巴结转移有关。许多研究显示，VEGF-C在胃癌、前列腺癌、直肠癌、乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤组织中过表达，并与淋巴结转移和淋巴管生成正相关，是理想的肿瘤基因治疗靶点。

基于上述研究，我们设计了针对VEGF-C基因的寡核苷酸序列，应用慢病毒表达载体构建siRNA表达体系并转染非小细胞肺癌细胞株，经real time RT-PCR、western blot检测VEGF-C mRNA和蛋白质的表达水平,研究其干扰VEGF-C基因表达的效应，为进一步研究VEGF-C功能及其作为抗肿瘤淋巴转移靶点可行性等研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供针对VEGF-C基因RNAi慢病毒重组表达载体pSIH1-H1-copGFP-VEGF-CsiRNA970的构建及制备方法，为肿瘤基因治疗提供新策略。本发明的另一目的是提供新的抗肿瘤生物制剂和抗肿瘤基因药物。

本发明的技术解决方案是，慢病毒介导的针对VEGF-C基因siRNA重组体970，其碱基序列为：5’CCTCAGCAAGACGTTATTT3’。