[发明专利]诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法与应用

说明书

技术领域

本发明为诱导干细胞分化的生物技术领域，特别涉及一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法与应用。

背景技术

随着人均寿命的延长，人口老龄化问题越来越严重，中老年男性雄激素部分缺乏症(PADAM)患者越来越多。目前临床上主要采用了外源性雄激素替代疗法(ART)，目的是维持血清中睾酮的生理浓度，以替代内源性睾酮的生理功能。然而长期服用雄激素副作用较大，其一体内雄激素的靶细胞较多，长期服用外源雄激素治疗容易会有毒副作用的发生，尤其是前列腺；其二不同个体间血清睾酮水平差异较大，病人需频繁抽血检查相关指标以调整用量；其三睾酮替代治疗会破坏人体雄激素分泌晨高夜低的自然节律，还会抑制自身睾丸的雄激素分泌和生精功能。

近年来随着细胞移植疗法的发展，人们把目光转向了采用睾丸间质细胞(Leydig cells)的移植。由于睾丸间质细胞分泌的睾酮约占血浆睾酮的95％，人们试图通过睾丸间质细胞的移植来治疗睾酮分泌不足的问题，睾丸间质细胞移植可以升高患者血清睾酮水平。采用将分离提纯的睾丸间质细胞微囊化的方法，既可以防止宿主对植入睾丸间质细胞的免疫排异反应，又保证微胶囊内睾丸间质细胞成活和睾酮分泌，微囊化后睾丸间质细胞能对人绒毛膜促性腺激素有良好的反应性，术后能在一定时间内保持患者血清睾酮水平。以上研究说明睾丸间质细胞移植可能是一种有效的治疗男性雄激素部分缺乏症的方法，但目前尚无法解决移植细胞来源的问题。

间充质干细胞具有多向分化能力，在一定的条件下，间充质干细胞能够被诱导分化为多种细胞，包括成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，神经细胞和肝细胞等。向骨髓间充质干细胞中转入类固醇生成因子-1(SF-1)基因，能产生具有合成性腺激素和肾上腺类型类固醇激素能力的细胞。但骨髓间充质干细胞体外增殖能力、多向分化能力以及细胞稳定性都会随着骨髓供体的年龄增长或疾病的影响逐渐不同程度的减弱甚至丧失；并且，骨髓间充质干细胞的分化效率较低，分泌的性腺激素量较低，需要寻找其他来源的干细胞和有效的诱导分化方法，可以更高效地将干细胞诱导分化为睾丸间质细胞。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种有效地诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法。

本发明的另一目的在于提供所述诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，包含以下步骤：

(1)将SF-1基因(NM 139051，核苷酸序列171-1828，如SEQ ID NO.1所示)插入腺病毒的穿梭质粒pAdtrack-CMV-EGFP的多克隆位点中，得到重组载体pAdtrack-CMV-SF-1；然后将重组载体pAdtrack-CMV-SF-1与腺病毒载体质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183，得到携带SF-1基因的腺病毒质粒pAd-SF-1；将腺病毒质粒pAd-SF-1单酶切线性化，转染人胚肾细胞AD-293后得到腺病毒。

(2)采用MOI＝200的量，将步骤(1)制备得到的腺病毒加入到诱导培养液中感染人脐带间充质干细胞，将人脐带间充质干细胞诱导分化为睾丸间质细胞；诱导培养液的组成为：基础培养基为DMEM/F12，含有体积百分比10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、500μM二丁酰环磷酸腺苷(dbcAMP)。

步骤(1)中所述的腺病毒质粒pAd-SF-1单酶切线性化是采用Pac I酶切进行线性化；

步骤(1)中所述的转染采用磷酸钙共沉淀法进行；

步骤(2)中所述的人脐带间充质干细胞通过如下方法制备得到：从正常的足月新生儿的人脐带中分离得到沃顿胶组织(Wharton’s jelly)，将沃顿胶组织剪碎，用培养液培养，待从组织块游离出来的细胞长至80～90％融合时，用胰酶消化游离出来的细胞，进行细胞传代培养，得到人脐带间充质干细胞；其中培养液为含有体积百分比10％的胎牛血清，5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，2mM L-谷氨酰胺，216μg/ml NaHCO₃，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和1μg/ml两性霉素B的LG-DMEM培养液。