[发明专利]诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法与应用

权利要求书

1.一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的SF-1基因插入腺病毒的穿梭质粒pAdtrack-CMV-EGFP的多克隆位点中，得到重组载体pAdtrack-CMV-SF-1；然后将重组载体pAdtrack-CMV-SF-1与腺病毒载体质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183，得到携带SF-1基因的腺病毒质粒pAd-SF-1；将腺病毒质粒pAd-SF-1单酶切线性化，转染人胚肾细胞AD-293后得到腺病毒；

(2)采用MOI＝200的量，将步骤(1)制备得到的腺病毒加入到诱导培养液中感染人脐带间充质干细胞，将人脐带间充质干细胞诱导分化为睾丸间质细胞；诱导培养液的组成为：基础培养基为DMEM/F12，含有体积百分比10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、500μM二丁酰环磷酸腺苷。

2.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的腺病毒质粒pAd-SF-1单酶切线性化是通过Pac I酶切进行线性化。

3.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的转染为通过磷酸钙共沉淀法进行。

4.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的人脐带间充质干细胞通过如下方法制备得到：首先从正常的足月新生儿的人脐带中分离得到沃顿胶组织，将沃顿胶组织剪碎，用培养液培养，待从组织块游离出来的细胞长至80～90％融合时，用胰酶消化游离出来的细胞，进行细胞传代培养，得到人脐带间充质干细胞；其中培养液为含有体积百分比10％的胎牛血清，5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，2mM L-谷氨酰胺，216μg/ml NaHCO₃，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和1μg/ml两性霉素B的LG-DMEM培养液。

5.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：所述的人脐带间充质干细胞的细胞表面抗原分子为通过FACScan流式细胞仪进行检测，人脐带间充质干细胞不表达造血标志分子CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR，而强表达间充质干细胞表面特异性抗原CD44、CD73、CD90和CD105；流式细胞的鉴定条件为：细胞的密度不低于10⁶/ml，采用mouse anti IgG1/PE和mouse anti IgG1/FITC作为同型对照；

所述的人脐带间充质干细胞通过成骨分化，成脂和成软骨分化鉴定干细胞的分化能力，成脂分化用油红染色鉴定，成骨分化用碱性磷酸酶染色及Von kossa染色鉴定，成软骨分化用亚甲基蓝染色鉴定。

6.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中所述诱导分化的条件为用胰酶将人脐带间充质干细胞消化，离心收集，按5×10⁵细胞/孔的密度接种到6孔板，在培养箱培养过夜让细胞贴壁，接着更换诱导培养液，以MOI＝200的量将腺病毒加入到诱导培养液中，轻摇动培养板使病毒分布均匀，然后每两天更换新鲜诱导培养液；诱导分化7天。

7.权利要求1～6任一项所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法的应用，其特征在于：所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法用于诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞。

8.一种睾丸间质细胞，通过权利要求1～6任一项所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法得到。

9.一种睾酮，通过权利要求8所述的睾丸间质细胞分泌得到。