[发明专利]一种培养基倒置悬空法组织分离野生食用菌菌种的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种培养基倒置悬空法组织分离野生食用菌菌种的方法，属于微生物菌种分离方法。

研究背景

菌种分离是将有价值的子实体的局部组织、孢子或基内菌丝移接到斜面试管培养基上，从而获得纯培养菌丝。菌种资源的获得有野外采集和栽培场所采集两种途径。野外标本的采集，主要适用于食用菌的野生种驯化、遗传育种、生理生态以及各种研究用的一级种的分离。而在食用菌栽培上一级种的分离，其种菇的来源主要是从栽培场中经留种获得的。

食用菌菌种是重要的生产资料，也是教学、科研上的重要实验材料。菌种质量的好坏直接影响栽培的成败和产量的高低，只有优良的菌种才能获得高产和优质的产品，因此生产优良的菌种是食用菌栽培的一个极其重要的环节。根据菌种的来源、繁殖代数及生产目的，把菌种分为母种、原种和栽培种、用子实体分离，通常在子实体大量出现时期。最好在采集当天就进行分离。一般应选取幼嫩、坚实、干爽、无病的子实体为分离对象。

无论是人工栽培子实体还是液体发酵菌丝体生产，获得高品质的优良菌种是关键。进行菌种分离是食用菌栽培中的一个重要环节。菌种分离须按一个严格的无菌操作程序进行。菌种分离可以分为孢子分离、组织分离和基内菌丝分离三种。

食用菌菌种分离的组织分离法包括子实体、菌核，菌索内部组织获得纯培养的方法都属于组织分离法。实际生产中用最多的就是组织分离法，常规的组织分离方法是：选择优良的种菇作为分离材料，用无菌水冲洗后，用75％的酒精溶液表面消毒。取消毒过的刀片从菌柄或菌盖中部纵切、撕开，挑取菌盖与菌柄交界处的一小块组织(火柴头大小)，接种到PDA培养基上3-5天后，接种块上产生白色绒毛状菌丝。但目前分离野生食用菌存在的问题主要是：野生食用菌一般生长在野外，外附杂物及杂菌较多，部分又遭虫蚀，分离的菌种块极易污染，不容易分离成功。

发明内容

本发明的目的在于提供一种培养基倒置悬空法组织分离野生食用菌菌种的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种培养基倒置悬空法组织分离野生食用菌菌种的方法，包括以下步骤：取子实体，用胶带包裹，75％的酒精擦洗外表面，纵向切开子实体，削取子实体厚实的地方组织块，在酒精灯火焰上快速来回过火2-3次送入试管，此时试管培养基表面向下，再用接种针送到试管底部分离培养基的下面，距离分离培养基2-4mm，并保持此种状态培养，温度28-30℃，相对湿度70-90％的状态下保湿培养7-10d，组织块萌发的菌丝即可向上对接培养基而成活。

所述的子实体先用无菌刷子刷去菇体表面的杂质。

纵向切开子实体采用手术刀进行。

所述的分离培养基由以下原料组成：马铃薯350-450g，发酵腐熟牛粪90-110g，葡萄糖15-25g，磷酸二氢钾0.5-1.2g，硫酸镁0.2-1.8g，酵母膏45-55g，琼脂15-25g、水1000mL，链霉素50U/mL，青霉素50U/mL，pH6.5。

所述分离培养基的制备方法为：将土豆削皮切薄皮加3000mL水煮30min，过滤取2000mL，加入发酵腐熟的牛粪。小火浸煮20min，过滤取滤液1000mL；在此滤液中加入琼脂后继续加热，火力大小以不溢出为好，同时不停搅拌，防止糊锅，待其完全溶化后，再加入葡萄糖、酵母膏、、磷酸二氢钾、硫酸镁、链霉素和青霉素各50000U，搅拌均匀，定容至1000mL；将已制备好的培养基趁热分装于试管内，每支5mL，用太空棉棉塞紧试管口，7支一把，高压灭菌，温度121℃，时间50min，试管培养基摆成大斜面，覆盖报纸停放2-4d，散去培养基表面的水分，利用食用菌菌组织保湿萌发，自然接种到悬空的培养基上。

通常情况下，食用菌子实体不能使用75％酒精搽拭，酒精很容易浸入子实体，造成组织块不萌发；而本发明采用胶带包裹子实体，可用酒精消毒搽拭，有效防止了子实体表面的杂菌在操作的空间造成污染；抗生素直接加入分离培养基，具有抗细菌活性。野生食用菌附带杂菌颇多，采用组织块保湿萌发后悬空接种，成功机率达到80％以上。本发明是针对外附杂菌较多的野生食用菌，本发明中的菌种块一般取较大组织块，容易萌发菌丝，和培养基隔空对应培养，通过萌发的气生菌丝接种到悬空在组织块上方的空白培养基，不易污染，成功率比较高。

附图说明

图1为本发明的接种块位置示意图。

具体实施方式