[发明专利]一种鱼类广谱弧菌亚单位疫苗及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鱼类广谱弧菌亚单位疫苗及制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

近年来，人工鱼类养殖规模迅速扩大，生产集约化程度不断提高。病害已经成为制约水产养殖业健康发展的瓶颈。据统计，全国水产养殖病害发病率达50%以上，损失率30%左右，每年直接损失高达百亿元之巨。在众多的细菌性病害中，弧菌病被公认为是鱼类养殖中最为严重的病害之一。主要的致病性弧菌包括：副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌。

随着水产养殖微生物病害的施虐，滥用抗生素的状况也愈发严重。抗生素残留引起的食品安全问题事关人们的身体健康和民生大事，已引起各国政府高度重视的问题。高效广谱弧菌疫苗的研发和应用有利于减少抗生素的滥用，保证水产品的食品安全; 同时可以防治致病微生物的感染，减少水产养殖病害发病率。

目前国外有近30多种商品化的鱼用疫苗。我国鱼用疫苗的研究起步较晚,获得国家新兽药证书的水产疫苗仅有3种，分别为草鱼出血病细胞灭活疫苗、嗜水气单胞菌病灭活疫苗以及牙鲆鱼溶藻弧菌、鳗弧菌、迟缓爱德华菌病多联抗独特型抗体疫苗。目前并没有一种有效地能够防治多种致病性弧菌对鱼类感染的疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鱼类广谱弧菌亚单位疫苗及制备方法，该疫苗疫苗具广谱性，可用于防治多种致病性弧菌引起的鱼类弧菌病。

本发明首先提供了一种鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，所述疫苗以副溶血弧菌外膜蛋白OmpK和鞭毛蛋白FlaA的融合蛋白FlaA-OmpK作为抗原成分。抗原成分为FlaA和OmpK通过连接肽G1y₄Ser相连成重组融合蛋白FlaA-OmpK；重组融合蛋白FlaA-OmpK的氨基酸序列如SEQ.NO.1所示。

其中OmpK是主要的抗原成分。副溶血弧菌外膜蛋白OmpK与其他主要致病弧菌的外膜蛋白K的同源性高达95％以上。FlaA-OmpK亚单位疫苗具有良好的广谱性, 诱发产生的抗OmpK抗体对多种致病性弧菌（副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌）具有良好的交叉反应性, 可用于防治多种致病性弧菌（付溶血弧菌、溶藻胶弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌）对鱼类的感染。

鞭毛蛋白FlaA能够激活鱼肠道粘膜的TLR5受体，进而激活机体先天性免疫系统，具有增强免疫效果的佐剂作用。融和蛋白FLaA-OmpK具有很强的免疫原性, 诱发有效抗体的作用明显强于蛋白混合物FLaA＋OmpK以及蛋白OmpK。

本发明的鱼类广谱弧菌亚单位疫苗诱发的抗体对于副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌具有良好的交叉反应性，可用于防治副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌对鱼类的感染。

所述疫苗的类型为腹腔注射疫苗或口服肠溶微球疫苗，免疫方式为腹腔注射免疫或口服免疫。

腹腔注射免疫时, 疫苗为重组融合蛋白FlaA-OmpK的生理盐水溶液,免疫剂量为80-100μg/次，按100g体重计；口服免疫时, 将口服肠溶微球疫苗掺合饵料中, 自然摄食,免疫剂量为80-200μg/天，按100g体重计, 连续2-4天口服免疫。

所述口服肠溶微球疫苗，采用丙烯酸树脂包裹融合蛋白FlaA-OmpK，使其具有肠溶功能，同时所制备的口服疫苗为微球状，粒径10－50nm。

所述口服肠溶微球疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1) 融合蛋白FlaA-OmpK 100mg溶于20mL TE-buffer中，10-30g丙烯酸树脂Ⅱ号溶于250mL乙醇中 ,这两种溶液在搅拌条件下混合均匀，作为内油相；

(2)内油相在10000r/min搅拌条件下缓慢加入1000mL液体石蜡，所述液体石蜡含0.1-1.0mL卵磷脂和0.1-0.6% Span80，乳化30min后，改为常规搅拌600r/min，持续搅拌至乙醇完全挥发，微球固化；

(3)离心收集微球颗粒，用乙醇洗涤数次，60℃干燥4h，即得口服肠溶微球疫苗。按照鱼的个体重量和摄食习惯，将所需剂量的口服肠溶疫苗微球与粉状鱼饲料按一定的比例混合，挤压成型，即可直接投料喂养，达到口服免疫效果。

所述融合蛋白FlaA-OmpK的制备包括如下步骤：

(1)以副溶血弧菌的DNA为模板, 进行PCR扩增，分别获得目标基因flaA和ompK；

(2)采用重叠延伸PCR技术，获得融合蛋白基因flaA-ompK；