[发明专利]一种鱼类广谱弧菌亚单位疫苗及制备方法

权利要求书

1.一种鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗以副溶血弧菌外膜蛋白OmpK和鞭毛蛋白FlaA的融合蛋白FlaA-OmpK作为抗原成分。

2.根据权利要求1所述的鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，其特征在于，抗原成分为FlaA和OmpK通过连接肽G1y₄Ser相连成重组融合蛋白FlaA-OmpK；重组融合蛋白FlaA-OmpK的氨基酸序列如SEQ.NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，其特征在于，该疫苗用于防治副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌对鱼类的感染。

4.根据权利要求1所述的鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗的类型为腹腔注射疫苗或口服肠溶微球疫苗，免疫方式为腹腔注射免疫或口服免疫。

5.根据权利要求4所述的鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，其特征在于：腹腔注射免疫时, 疫苗为重组融合蛋白FlaA-OmpK的生理盐水溶液,免疫剂量为80-100μg/次，按100g体重计；口服免疫时, 将口服肠溶微球疫苗掺合饵料中, 自然摄食,免疫剂量为80-200μg/天，按100g体重计, 连续2-4天口服免疫。

6.根据权利要求4所述的鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，其特征在于：所述口服肠溶微球疫苗，采用丙烯酸树脂包裹融合蛋白FlaA-OmpK，使其具有肠溶功能，同时所制备的口服疫苗为微球状，粒径10－50nm。

7.根据权利要求4或6所述的鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，其特征在于：所述口服肠溶微球疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1) 融合蛋白FlaA-OmpK 100mg溶于20mL TE-buffer中，10-30g丙烯酸树脂Ⅱ号溶于250mL乙醇中 ,这两种溶液在搅拌条件下混合均匀，作为内油相；

(2)内油相在10000r/min搅拌条件下缓慢加入1000mL液体石蜡，所述液体石蜡含0.1-1.0mL卵磷脂和0.1-0.6% Span80，乳化30min后，改为常规搅拌600r/min，持续搅拌至乙醇完全挥发，微球固化；

(3)离心收集微球颗粒，用乙醇洗涤数次，60℃干燥4h，即得口服肠溶微球疫苗。

8.根据权利要求1或2所述的鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，其特征在于：所述融合蛋白FlaA-OmpK的制备包括如下步骤：

(1)以副溶血弧菌的DNA为模板, 进行PCR扩增，分别获得目标基因flaA和ompK；

(2)采用重叠延伸PCR技术，获得融合蛋白基因flaA-ompK；

(3)选用表达载体pET-28a，构建重组质粒flaA-ompK—pET-28a；转入感受态大肠杆菌BL21，筛选转化子；在IPTG诱导下表达目标蛋白；经镍柱亲和层析法纯化得到融合蛋白FlaA-OmpK。