[发明专利]一种提取动物组织样品中病原核酸的试剂

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种动物组织样品中携带病原核酸的提取试剂。

背景技术

近年来，甲型H1N1流感、禽流感等烈性人畜共患病在世界上呈现爆发性流行，在国内已经造成了一定的经济损失，而且时刻威胁着国人的健康；非洲猪瘟、裂谷热等动物疫病已经逼近国境，尼帕病毒、裂谷热等新的动物源性人畜共患病在我国周边国家时有爆发等等。这一系列跨国境传播的潜在动物疫病，给我国防范高风险动物疫病在国内流行提出了严峻的考验。与此同时，随着我国外交外贸事业的发展，进出境动物及动物产品数量逐年增多，为防止口岸动物疫情传入传出，保障我国畜牧业生产安全以及国民身体健康，提高我国动物及其动物产品的国际竞争能力和适应“快检快放”大通关的需求，提高动物疫病口岸检出率，从而提高我国检验检疫系统的检疫把关能力非常必要。

目前，对动物疫病的检测主要依据的是分子生物学的技术，而分子生物学的基础是核酸抽提。其中酚抽提法、异丙醇沉淀法、甲酰胺裂解法及TriZol法是比较经典的核酸抽提方法，目前很多方法的改进都是在这些方法的基础上进行的，前面三种方法均是利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)消化破碎细胞，而TriZol法是用异硫氰酸胍消化破碎细胞。细胞破碎后甲酰胺法是利用高浓度的甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后利用透析来处理DNA样品，但其它三种方法则是先用酚/氯仿去除蛋白质，再分别用乙醇或异丙醇沉淀DNA。这些经典方法获得的核酸纯度比较高，基本能满足后续PCR及酶切等各种试验的要求，但存在很多缺陷：一是整个操作过程用时长，消化破碎细胞需放置2-3个小时或过夜；二是操作繁琐，需酚等有机试剂反复抽提以除去蛋白，且Trizol法还需要低温4℃离心；三是缺少能够更好的配合环介导等温扩增技术(LAMP)等口岸核酸快速检测技术的简便快速的核酸提取方法；四是提取效率受限，不能满足实验室核酸提取的精准要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、安全、快速的动物组织样品中携带病原核酸的提取试剂，以克服上述不足。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述试剂提取动物组织样品或细胞培养液中病原核酸的方法。

异硫氰酸胍是一种白色结晶性粉末，有刺激性，对光敏感，溶于乙醇和水，熔点118℃。用于变性裂解细胞和提取RNA和DNA，且无RNA酶和DNA酶活性。柠檬酸钠为无色或白色结晶颗粒或结晶性粉末，无嗅、味咸、凉、易溶于水、难溶于乙醇，过热分解，熔点150℃(此温度时失去结晶水)，溶液pH值约为8，柠檬酸钠安全无毒，具有金属离子络合能力和良好的pH调节及缓冲性能，还具有优良的缓凝性能及稳定性能，作为抗氧化剂抗凝剂广泛应用于化工和医药行业。十二烷基肌氨酸钠(SLS)为白色粉末，易溶于热水，属阴离子表面活性剂，具有优异的渗透、洗涤、润湿、去污和乳化作用。

本发明根据上述化学试剂的特性，研制了一种核酸的提取试剂，其配方为：溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：4M-6M异硫氰酸胍，20mM-25mM柠檬酸钠，质量百分比0.2％-0.5％的SLS。

优选地，本发明提供的核酸提取试剂，其配方为：溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：6M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，质量百分比0.5％的SLS。

本发明提供了上述试剂在提取动物组织样本和/或细胞培养物中DNA和/或RNA的应用。

本发明提供的试剂，其pH值为7-9。

当用于提取DNA时，所述试剂pH值为8-9，或，

用于提取RNA时，所述试剂pH值为7。

本发明提供了一种提取动物组织样品中携带的病原核酸的方法，包括如下步骤：

(1)动物组织预处理；

(2)裂解组织样本：在预处理后的动物组织中加入本发明的试剂，上下颠倒混匀；

(3)将样品室温放置10-30min后，15-25℃，13000g离心5min，去除杂质；

(4)核酸沉淀：将步骤(3)的上清液转移到新管，加入异丙醇，异丙醇加入量为步骤(2)中试剂加入量的一半，来回颠倒混匀，10000g离心8-10min，弃去上清；加75％乙醇洗涤核酸沉淀，5000g离心3min，倒去上清，室温干燥2-3min；

(5)加入无核酸酶的无菌水溶解核酸沉淀，55℃放置2min。。

其中，步骤(1)所述的动物组织预处理方法为匀浆或液氮研磨。

其中，步骤(2)试剂的用量为30-70mg动物组织中加入1mL本发明提供的提取动物组织样品中病原核酸的试剂。