[发明专利]用连续传代细胞系生产鸡马立克氏病疫苗及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用连续传代细胞系生产鸡马立克氏病疫苗及方法，特别是指一种用鹌鹑肉瘤纤维细胞QT6生产鸡马立克氏病疫苗及其方法。

背景技术

马立克氏病(Marek’s disease，MD)是由疱疹病毒科的马立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)引起的鸡的一种传染性肿瘤性疾病，以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征，在外周神经、性腺、虹膜各种脏器、肌肉和皮肤发生单核细胞浸润。MD在临床上引起肿瘤和死亡的同时，更重要的是损害感染鸡的免疫器官，造成免疫抑制，导致机体抵抗力下降和对接种疫苗的免疫应答降低或不应答，引发其他多种疾病的并发和继发感染，造成巨大的经济损失。

疫苗接种仍是目前控制马立克氏病的有效途径之一。目前使用的商品化鸡马立克氏病疫苗大都是用原代鸡胚成纤维细胞作为制苗材料。制备原代细胞的方法不但费时而且成本高。生产疫苗的大约30％的成本是用于制备鸡胚成纤维细胞。疫苗生产十分依赖SPF种蛋的供应。SPF禽群在特殊条件下饲养并且定期证明其不含禽类病原体。SPF种蛋的供应的任何中断都将中断MDV疫苗的生产。并且每次制备的原代细胞劳动强度大，批间差异也大，从而引起质量不稳定，操作过程易污染，疫苗产量及质量受到极大限制。

家禽养殖工业一直以来急需可用于生产马立克氏病疫苗的连续传代细胞系。尽管发展了许多禽类或哺乳动物细胞系(如EP0748867和EP0884382)，但依然没有连续细胞系可以在马立克氏病疫苗中作为有效的鸡胚成纤维细胞(CEF)的替代物。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种利用可连续传代的传代细胞系生产马立克氏病疫苗，以实现通过使用可传代培养的成纤维细胞系——鹌鹑肉瘤纤维细胞系QT6(保藏号为ATCC CRL-1708)，替代原代鸡胚成纤维细胞，用于连续化工业生产鸡马立克氏病疫苗，从而获得一种疫苗质量和产量高、批次差异小、免疫效力稳定的马立克氏病疫苗。

技术方案

一种连续传代细胞系生产的马立克氏病疫苗，其中，每支马立克氏病疫苗成品(2ml体积)中包含以下组分：

Ham′s F12K培养液：1.4～1.7ml；

胎牛血清：         0.2～0.4ml；

DMSO：             0.1～0.2ml；

其中，马立克氏病病毒含量≥6×10⁶PFU，所述的马立克氏病病毒为使用传代细胞系生产获得。

优选地，本发明所述传代细胞系为鹌鹑肉瘤纤维细胞系QT6，该细胞系为可传代培养的成纤维细胞系，购自ATCC CRL-1708。

优选地，本发明所述马立克氏病病毒为马立克氏病病毒CVI988/Rispens株，为商品化的病毒株，并在《鸡马立克氏病CVI988_Rispens毒株生物学特性的研究》(中国兽医杂志，2002年第38卷第5期)中公开。

本发明对马立克氏病病毒的类型没有特别地限定，优选地，本发明所述马立克氏病病毒为血清I型、血清II型或血清III型中的任意一个或多个的组合。

优选地，本发明所述马立克氏病疫苗为液氮疫苗或冻干疫苗。

上述马立克氏病病毒及马立克氏病疫苗是通过下述方法获得的，即用连续传代细胞系生产马立克氏病疫苗的方法，包括以下步骤：

1)传代细胞的传代与培养：将传代细胞使用细胞分散液进行消化传代，用细胞生长液培养，以形成良好的细胞单层；

2)细胞毒种的繁殖：将马立克氏病病毒在步骤1)获得的形成良好的细胞单层的传代细胞继代，以获得工作种毒；

3)工作种毒的繁殖：将步骤1)获得的形成良好的细胞单层的传代细胞，弃去细胞生长液，接种含细胞维持液的工作种毒，在37～38℃下培养；

4)当培养至CPE≥80％以上时，收获马立克氏病病毒，并配苗分装以获得马立克氏病疫苗。

其中，配苗之前收获马立克氏病病毒的方法为：

培养至80％以上的细胞出现致病变效应时，即可收获，弃去细胞维持液，加入EDTA-胰酶细胞分散液，使消化液与细胞充分接触后，弃去胰酶液，加入细胞维持液，停止消化，收获马立克氏病病毒，无菌检验后，分至离心瓶中；于2～8℃、1500r/min离心10～20min，离心后弃去上清，收集沉淀细胞(其含有马立克氏病病毒)。

其中，配苗时使用的培养液及比例如下：