[发明专利]猪假attp位点及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域。具体地，本发明涉及猪假attp位点及其用途。更具体地，本发明涉及一种分离的可被ΦC31整合酶识别的寡核苷酸，一种适于转化猪细胞的载体，一组适于转化猪细胞的载体，一种转基因猪细胞或其培养物，一种制备转基因猪细胞的方法，以及一种确定猪基因组中假attp位点序列。

背景技术

现有的动物转基因技术大部分基于随机整合，一方面整合效率低，且为随机整合，位点不可预测；另一方面遗传不稳定，容易导致传代丢失，不利于培育稳定的品系；最后，转基因在宿主基因组中的随机插入可能导致内源基因的破坏或失活，也可能激活某些正常状态下关闭的基因，容易引起动物异常。这些都极大影响转基因技术的应用。

目前的动物转基因技术仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效地在猪细胞中引入外源基因的手段。

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的可被ΦC31整合酶识别的寡核苷酸，其特征在于，其包含如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。由此，本发明提出了一种猪假attp位点，其能够有效地在ΦC31整合酶的介导下，在猪细胞中引入外源基因。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种适于转化猪细胞的载体，其特征在于，包括：第一核酸序列，所述第一核酸序列适于在ΦC31整合酶的介导下与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列发生重组；以及目的基因。由此，利用该载体，能够在ΦC31整合酶的介导下通过与猪假attp位点的重组，将目的基因有效地引入到猪细胞中。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一组适于转化猪细胞的载体。根据本发明的实施例，该一组适于转化猪细胞的载体包括：

第一载体，所述第一载体包括：

第一核酸序列，所述第一核酸序列适于在ΦC31整合酶的介导下与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列发生重组；以及

目的基因，

第二载体，所述第二载体包括编码ΦC31整合酶或其功能等同体的核酸序列。

利用根据本发明实施例的一组适于转化猪细胞的载体，能够有效地实现将目的基因引入到猪细胞中。

根据本发明的第四方面，本发明一种转基因猪细胞或其培养物，其特征在于，在所述转基因猪细胞的1号染色体上包含表达外源基因的核酸序列，所述核酸序列插入所述1号染色体的假attp位点中。由此，可以有效地利用猪细胞或其培养物，表达外源基因，并且不会影响猪细胞的正常生理活动。

根据本发明的第五方面，本发明提出了一种制备前述转基因猪细胞的方法，其特征在于，包括下列：使用前面所述的一组适于转化猪细胞的载体转化猪细胞，以便获得转基因猪细胞；以及分离转基因猪细胞。利用该方法，能够有效地获得在1号染色体上包含外源基因的转基因猪细胞。

根据本发明的第六方面，本发明提出了一种确定猪基因组中假attp位点序列的方法。根据本发明的实施例，该方法包括下列步骤：根据前面所述的方法制备转基因猪细胞；分离所述转基因猪细胞的基因组DNA；使用限制性内切酶对所述基因组DNA进行酶切消化，以便获得具有粘性末端的DNA片段；将所述DNA片段与相应的接头相连，以便获得连接产物；使用第一PCR引物组，对所述连接产物进行第一PCR扩增，以便获得第一扩增产物；使用第二PCR引物组，对所述第一扩增产物进行第二PCR扩增，以便获得第二扩增产物；对所述第二扩增产物进行测序，以便获得测序结果，其中，所述测序结果中包含所述假attp位点的部分序列；基于所述测序结果，确定所述假attp位点的序列。利用该方法，能够有效地确定猪基因组中假attp位点的序列。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明的一个实施例，确定猪基因组中假attp位点序列的方法的流程示意图；

图2是根据本发明的一个实施例，Splinkerette PCR扩增产物的电泳照片，其中图2A是Splinkerette PCR第一轮扩增产物的电泳图，图2B是Splinkerette PCR第二轮扩增产物电泳图。

具体实施方式