[发明专利]家蝇对DDVP抗药性快速检测的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种家蝇对有机磷杀虫剂DDVP抗药性的快速检测方法及试剂盒，是利用生物化学的手段对家蝇抗药性进行检测。

背景技术

目前，敌敌畏DDVP、杀螟硫磷、辛硫磷等有机磷杀虫剂及各种复配剂被广泛应用于防治林业和农业害虫中；城市中园林绿地的害虫防治及卫生害虫防治的空间喷洒也是有机磷类杀虫剂使用较多。在DDVP等有机磷杀虫剂长期的选择压力下，大部分地区的家蝇对其产生了抗药性，所以虽然用药剂量逐渐加大，但防治效果普遍降低且对环境污染严重。了解某地区家蝇的抗药性情况可以规范杀虫剂的使用，对抗药性的治理和防治效率的提高有重要的指导作用和理论意义。

目前对于家蝇抗药性的检测，有生物测定方法、生物化学方法、免疫学方法、分子生物学方法等多种方法，然而受技术水平和实验仪器等限制，我国长期以来使用最多的还是传统的点滴法、药膜法等生物测定方法，具有较大的局限性。目前不论哪种测定方法，都需要花费较长时间，而且基本无法在现场进行快速检测，对杀虫剂使用的指导作用不够及时。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种可在现场进行快速检测的家蝇对DDVP抗药性快速检测的方法，本发明的另一目的是提供一种家蝇对DDVP抗药性快速检测的试剂盒。

为实现上述目的，本发明家蝇对DDVP抗药性快速检测的方法，具体为：家蝇体内的乙酰胆碱酯酶AChE作为DDVP的作用靶标，AChE能够分解底物碘代硫化乙酰胆碱ATCh为乙酸和碘化硫代胆碱，利用该碘化硫代胆碱与巯基显色剂5，5-双二硫代DNTB来进行颜色反应，生成黄色络合物5-巯基-2-硝基苯甲酸；当AChE未被抑制即有抗性时，所述颜色反应显示为黄色；当AChE被抑制即敏感时，所述颜色反应显示为无色。

进一步，所述方法的具体步骤为：

1)家蝇粗酶源样品的制备

将羽化后2-3日的家蝇成虫置于-80℃超低温冰箱内设定时间，用镊子取其头部放入离心管中，加入冰冷磷酸缓冲液，匀浆并离心处理后，取上清液作为酶源，保存备用；采用乙酰胆碱脂酶AChE作为阳性对照反应，采用丙酮为阴性对照反应

2)颜色反应

分别取设定量的样品于透明离心管内，加入DDVP丙酮溶液，充分混合、静置，加入Ellman溶液，均匀混合后静置，依据AChE颜色反应原理，通过肉眼观察反应液颜色变化情况；

3)结果判读

溶液显黄色为抗性品系，说明家蝇AChE活性不能被该浓度DDVP抑制；溶液呈无色说明AChE活性被抑制，为敏感品系；同时阳性对照显示黄色，阴性对照显示无色。

进一步，所述步骤1)中磷酸缓冲液浓度为25mmol/L，pH＝7.4，含0.1％曲通-100。

进一步，所述步骤1)中整个操作在冰上进行。

进一步，所述家蝇的敏感品系的AChE抑制时，DDVP的浓度为0.04mg/mL～0.16mg/mL之间。

进一步，所述家蝇的敏感品系的AChE完全抑制时，DDVP的浓度为0.08mg/mL。

一种实施上述方法的家蝇对DDVP抗药性快速检测的试剂盒，包括盒体和取液器，其中盒体中设置有含0.1％曲通-100的25mmol/L磷酸缓冲液的PB缓冲液试剂瓶、含乙酰胆碱ATCh的底物试剂瓶、含二硫双对硝基苯甲酸的PB溶液显色剂试剂瓶、含DDVP丙酮溶液的抑制剂试剂瓶、含0.05mg/mL乙酰胆碱脂酶AChE的阳性对照试剂瓶、含丙酮溶液的阴性对照试剂瓶。

本发明通过检测家蝇体内AChE被DDVP杀虫剂作用后的活性，结合家蝇生物测定所确定的抗药性水平，找出区分敏感品系与抗性品系的DDVP抑制浓度，从而利用生物化学发光方法，建立一种快速检测家蝇对DDVP杀虫剂抗药性的方法。

附图说明

图1为DDVP对4种不同品系家蝇AChE的抑制曲线图；

图2为不同浓度DDVP作用S家蝇AChE显色反应结果显示图；

图3为不同浓度DDVP作用YF₉家蝇AChE显色反应结果显示图；

图4为不同浓度DDVP作用YF₁₃家蝇AChE显色反应结果显示图；

图5为不同浓度DDVP作用YF₁₇家蝇AChE显色反应结果显示图；

图6为快速检测方法评价的结果显示图。

具体实施方式