[发明专利]一种实现细胞集落均质性生长的装置和方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞集落生长装置，特别涉及一种实现全能干细胞集落均质性生长的装置，同时也涉及利用该装置调控全能干细胞的自我更新和定向分化的方法。

背景技术

全能干细胞(totipotent stem cell，TSC)是指具有无限分化潜能，能分化成所有组织和器官的干细胞，主要包括胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPS)两类。

胚胎干细胞是从哺乳动物早期胚胎中分离培养出来的，其特点是具有发育的全能性，参与整个生物体的发育，并构成人体的各种组织和器官。胚胎干细胞取自原肠胚期的囊胚，进一步分化可形成专能干细胞。如肝脏祖细胞，骨髓造血干细胞等。从技术角度来说，“全能性”的胚胎干细胞对于治疗性克隆来说是最理想的。

然而，由于人类胚胎干细胞研究触及伦理和道德，在很多国家被法律禁止，相关研究也处于进退两难的境地。2007年，日本和美国科学家分别宣布发现将普通皮肤细胞转化为干细胞的方法，这样得到的干细胞和具有与胚胎干细胞类似的功能，被称为诱导多功能干细胞，即iPS细胞。这一发现分别被《自然》和《科学》两大权威科学杂志评为当年重大科学进展。

iPS细胞是“初始化”后的普通体细胞，但具有和胚胎干细胞类似的功能，能分化生成各种组织细胞。更重要的是，它绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍，医疗领域的应用前景非常广阔。美国、日本等许多国家更是以极大热情，或加大投入，或制订鼓励政策，推动这一新兴的干细胞研究。中国干细胞基础研究和应用研究起步较早，2001年后，与干细胞相关的重大研究项目不少于二十个。此外，国家还在研发网络建设、人才建设、研究平台搭建等方面给予了大力支持，为中国在该研究领域的优势地位奠定了基础。中科院动物研究所周琪和北京生命科学研究所高绍荣的研究团队分别利用iPS细胞克隆出小鼠，从而在世界上首次证明了iPS细胞的全能性，说明完全通过体外操作可得到与胚胎干细胞具有同样分化能力的细胞。这项成果是从干细胞研究迈向实际医疗过程中的一大步，对干细胞全能性的机理研究以及器官移植、药物筛选、基因治疗等临床应用研究具有重要价值。

全能干细胞的集落性生长对于干细胞全能性的维持具有非常重要的作用。以人胚胎干细胞(hESC)为例，经典培养方法是在以小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为代表的经过灭活的饲养层细胞上进行的，同时也有研究证实，在合适的化学因素作用下，细胞外基质也能作为培养基底维持hESC的自我更新，如基质胶、胶原、层连接蛋白、纤维连接蛋白中的一种或其混合物。在单细胞状态下，hESC的存活率较低，因此经典的传代方法是将其集落消化或切碎成为含有约100个细胞的团簇。无论采用何种传代技术，操作关键是将hESC保持在细胞团簇的状态。然而，这种方法很大程度上取决于操作人员的素质和手法，并最终形成形状和大小随机的、细胞密度随机的、异质性的hESC集落，但同时过大或者过小的细胞团簇都有更明显的分化趋势。正是由于全能干细胞自我更新的特殊要求，现阶段的培养和传代方法很难得到均质性的全能干细胞集落。

目前，越来越多的研究证明，全能干细胞集落的均质性对其自我更新和后续分化都具有至关重要的意义。以hESC为例，集落的尺寸和细胞组成对分化诱导因素和全能性维持因素有调节作用，尤其是与集落尺寸直接相关的Smad1信号是由胚胎干细胞和胚胎干细胞衍生的胚胎内胚层细胞的拮抗作用激发的，介导胚胎内胚层细胞的分泌骨形态发生蛋白-2(BMP2)和胚胎干细胞分泌的生长分化因子-3(GDF3)发生作用。通过单独调控Smad1激活可以拯救胚胎干细胞的自发分化，提示hESC集落的大小可以独立调控干细胞的分化和自我更新，但是在经典培养条件下无法调节集落尺寸大小，在随机的集落尺寸、细胞密度和分子微环境的共同作用下必然存在不可控的自发分化，影响胚胎干细胞的增殖和自我更新。