[发明专利]一种提取梨花粉管细胞核的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物生物化学领域，涉及一种提取梨花粉管细胞核的方法，具体涉及一种利用细胞化学处理及亚细胞器分级筛选技术从梨花粉管中提取纯化细胞核的方法。

背景技术

细胞核几乎含有所有的遗传信息，对基因表达和调控极其重要。随着基因组测序的发展，DNA纤维荧光原位杂交及大片段基因组文库的构建对植物全基因组测序具有重要推动作用。而提取纯化的细胞核是制作DNA纤维和构建大片段基因组文库的基础。细胞核除了含有DNA和RNA外，还含有一些蛋白质，并且这些蛋白随着胞内及胞外环境不同呈现出动态变化，从而参与不同的细胞行为调控。这些蛋白涉及信号转导、基因调控、蛋白水解及程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)等。因此提取纯化细胞核对于从基因组及蛋白质组学水平研究其生理调控机制具有重要意义。

目前细胞核提取技术多数采用传统研磨植物组织或是先通过酶解法提取原生质体，然后经绸布过滤、离心获得细胞核，如大豆下胚轴组织(1981)、爬山虎冠瘿瘤愈伤组织(1981)、大豆SB-1细胞系(1988)、蒜瓣(1990)细胞核提取。此外，棉花子叶(2009)细胞核提取技术主要采用刀片将子叶切成碎释放细胞核，并通过滤膜过滤获得细胞核。梨花粉管是一种特殊的植物细胞，添加提取液后采用传统的研钵研磨手段难以完全将花粉管破壁，让细胞核随着胞质释放。同时采用传统的液氮研磨会将细胞器损坏，不适宜细胞核分离。而预先提取花粉管原生质体后再破壁提取细胞核，需要大量的纤维素酶、离析酶等，成本高，步骤复杂。细胞研磨液过滤后直接离心，纯化效果不佳，往往含有大量杂质。而密度离心具有较好的效果，但是传统的蔗糖等密度梯度不好控制，纯化得到的细胞核质量不佳。目前细胞核提取技术有许多不足，且不适宜花粉管细胞核提取，因此建立一套花粉管细胞核提取纯化技术对于研究梨花粉管生长代谢及自交不亲和反应具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取梨花粉管细胞核的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种提取梨花粉管细胞核的方法，该方法包括以下步骤：

1)采集花粉：采集大蕾期花药，干燥；干燥方法有多种：可以采用白炽灯照射或干燥硅胶阴干等。

2)花粉培养：分离干燥花药中的花粉，将其加入到花粉培养基中，避光条件下，25～28℃，140～180rpm，培养3～4h；

3)细胞核的释放：将培养好的花粉连同培养基倒入孔径为50μm的细胞筛a内，并使培养基通过细胞筛流出，迅速在细胞筛a底部加一个孔径为40μm的细胞筛b，将两个细胞筛放置于比其直径稍大的培养皿上，迅速将细胞核研磨液加入到细胞筛a中，用玻璃研棒以60～100rpm速度研磨，同时再次添加细胞核研磨液使释放的细胞核不断流出经细胞筛b过滤到培养皿中，以上操作均在4℃下进行；

4)细胞核纯化：将步骤3)所述培养皿中得到的液体加入到离心管中，在漩涡仪上微震动20～40秒，迅速离心(200g，4℃，5min)得上清即为粗细胞核；将上清液转移到Percoll(乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒)密度梯度工作液顶部离心(3500g，4℃，25min)；离心后，Percoll密度梯度工作液顶部为淡黄色的细胞质，底部沉淀为纯化的细胞核；

5)Percoll的去除：将纯化的细胞核悬浮于细胞核研磨液进行洗涤，并迅速离心(3500g，4℃，25min)；沉淀即为纯化后去除Percoll的梨花粉管细胞核，用研磨液悬浮备用。

上述的提取梨花粉管细胞核的方法，所述的花粉培养基配方为：100g/L蔗糖，0.3g/LCa(NO₃)₂·4H₂O，30mM MES(α-磺基甲脂磺酸钠)，150g/L PEG 4000(聚乙二醇4000)，0.1g/L硼酸溶于蒸馏水中并定容，用Tris碱调整pH值至5.8～6.5。

上述的提取梨花粉管细胞核的方法，所述的细胞核研磨液配方为：0.3M蔗糖，10mMNaCl(氯化钠)，10mM MES(α-磺基甲脂磺酸钠)，5mM EDTA(乙二胺四乙酸)，0.2mM精胺，0.5mM亚精胺，0.2mM PMSF(苯甲基磺酰氟)，5mM DTT(二硫苏糖醇)，0.2％(v/v)Triton-X-100，以NaOH(氢氧化钠)调整pH至6.0。