[发明专利]一种快速检测三聚氰胺的一步法酶联免疫检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种快速检测三聚氰胺的一步法酶联免疫检测试剂盒，其中包括：三聚氰胺特异性抗体、三聚氰胺标准品和三聚氰胺酶标记物。

2.根据权利要求1所述的快速检测三聚氰胺的一步法酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括包被有三聚氰胺特异性抗体的酶标板、三聚氰胺辣根过氧化物酶标记物工作液、三聚氰胺标准品溶液、显色剂、酶标物稀释液、洗涤液、终止液、浓缩样品稀释液。

3.根据权利要求1或2所述的快速检测三聚氰胺的一步法酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述三聚氰胺特异性抗体为多克隆抗体，优选兔抗三聚氰胺的多克隆抗体。

4.根据权利要求1或2所述的快速检测三聚氰胺的一步法酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的三聚氰胺酶标记物所用的酶为辣根过氧化物酶。

5.根据权利要求2所述的快速检测三聚氰胺的一步法酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的洗涤液为含有0.05％-0.5％吐温-20磷酸盐缓冲液，所述的终止液为2mol/L的盐酸溶液。

6.根据权利要求2所述的快速检测三聚氰胺的一步法酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的显色剂由过氧化氢或过氧化脲、邻苯二胺或四甲基联苯胺与稳定剂K按5∶5∶1的体积比混合而成，可在4℃下可以保存两年不变色。

7.根据权利要求2所述的快速检测三聚氰胺的一步法酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的浓缩样品稀释液为含0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液。

8.根据权利要求2所述的快速检测三聚氰胺的一步法酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的酶标物稀释液为含酶稳定剂AH与酶保护剂KEN的磷酸盐缓冲液；所述的三聚氰胺酶标记物为三聚氰胺辣根过氧化物酶标记物冻干粉，使用时用酶标物稀释液溶解为工作液即可直接可以应用。

9.一种快速检测样品中三聚氰胺含量的一步法酶联免疫检测方法，包括步骤：

(1)样品前处理：液态奶样品，取1.00mL到Eppendorf离心管中，4℃ 12000rpm离心5min后取中间的清液，直接用于后续实验，稀释倍数为1；奶粉取样品，准确称取2.00g到50mL离心管中，取10mL PBS加入到奶粉中，40℃水浴加热至奶粉完全溶解，4℃ 4000rpm离心10min后取中间的清液，直接用于后续实验，稀释倍数为5；奶制品与饲料样品，粉碎后准确称取2.00g到50mL离心管中，加入10mL 0.1M HCl，剧烈漩涡振荡后超声裂解样品25min，室温5000rpm离心10min，用1M NaOH调整pH值到8.0左右，室温5000rpm离心5min或0.4μm过滤器过滤至干净的管子中，上清液或过滤液用PBS按1∶1进一步稀释后，用于后续实验，稀释倍数为10；

(2)用权利要求1-9任一所述的快速检测三聚氰胺的一步法酶联免疫检测试剂盒进行检测，向包被有三聚氰胺抗体的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入三聚氰胺辣根过氧化物酶标记物工作液，按照说明书中说明的时间、温度和操作注意事项操作后，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值，(3)分析检测结果。

10.如权利要求9所述的快速检测样品中三聚氰胺含量的一步法酶联免疫检测方法，其中(2)为将包被液稀释成1.8μg/mL浓度的三聚氰胺抗体按每孔100μL包被酶标板，4℃包被过夜，洗涤液洗涤3次，拍干；按每孔200μL封闭液4℃下封闭过夜，洗涤3次，拍干备用。标准品孔每孔加入50μL系列浓度的三聚氰胺标准品(0、1、3、9、27、81ng/mL)，样品孔每孔加入50μL待测稀释好的样品，每孔加入50μL 1∶16000稀释的三聚氰胺辣根过氧化物酶标物，室温作用30min，洗涤3次，拍干；每孔加100μl显色剂，室温作用10min，每孔加入100μL终止液终止反应，酶标仪检测A值(450nm)。以结合率为纵坐标、三聚氰胺标准品浓度的对数为横坐标建立标准曲线，根据标准曲线计算并乘以其对应的稀释倍数即可得样品中三聚氰胺的含量。