[发明专利]一株苏云金芽孢杆菌ST7及其抗癌基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种苏云金芽孢杆菌ST7及其抗癌基因和应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性好氧细菌，它在形成芽孢的过程中，会在菌体的一端或两端形成一个或多个独特的伴胞晶体蛋白，这是唯一能区分两个分类学上的近缘物种B.thuringiensis和B.cereus的特征。不同菌株晶体蛋白的形状、大小和组分均各不相同，并且常常存在特异的杀虫活性，故称为杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)。这种蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物等都具有特异的杀虫活性(Faust RM.，et al.1983.Plasmid，9：98-103.)，而对哺乳动物没有任何有害作用，广泛应用于卫生与农业害虫的防治(Schnepf HE，et al.1998.Microbiol Mol Biol Rev，62：775-806)。Bt的杀虫晶体蛋白主要包含两个结构上无任何相关性的蛋白家族：Cry蛋白和Cyt蛋白，前者对特异的昆虫有毒性，而后者对无脊椎动物和脊椎动物细胞具有广泛的溶细胞活性，包括昆虫和哺乳动物红细胞。目前，Cry蛋白现在已被划分为69个不同类型：Cry1-Cry69，而Cyt仅有三个类型：Cyt1、Cyt2和Cyt3(http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt)(Crickmore N，Zeigler DR，Feitelson J.1998.Microbiol Mol Biol Rev，62：807-813.)。

至今人们已从世界各地的昆虫、土壤和植物体表等样本中分离到数万株Bt菌株，但其中绝大部分Bt菌株没有杀虫活性，因此这些菌株一直不受重视，它们的生物学特征也很少被研究过。直到1999年，日本学者Mizuki才对这类能产生晶体蛋白，而没有杀虫活性的Bt菌进行深入研究(Mizuki E.et al.1999.J Appl Microbiol，86：477-486)。他发现Bt菌株A1190所产生的81kDa伴孢晶体蛋白经蛋白酶处理激活后对体外培养的人癌细胞(人白血病T细胞MOLT-4、人子宫颈癌细胞等)具有杀伤能力，而且无溶血作用。此外，由于Cyt类杀虫晶体蛋白的溶细胞活性，Al-yahaeet等将Cyt2蛋白与肿瘤细胞抗体融合为一个特异破坏肿瘤细胞的融合蛋白进行临床研究，结果表明Cyt2蛋白对癌细胞具有抑制作用(Al-yahaee SA and Ellar DJ.1996.Bioconjug Chem，7：451-460)。该研究是继发现Bt以色列变种之后又一个与医学联系的全新领域，可能为抗癌药物的研究与发展开辟新的方向，引起了许多科学家的关注，并将这类具有抗癌活性的蛋白统称为Parasporin(PS)，具体定义为“Bt及其相关细菌产生的无溶血作用但可优先杀死癌细胞的伴胞晶体蛋白”(Kitada S，et al.2005.Victoria B C：Minireview，1-8.)。2006年，成立了以Michio Ohba为首的Parasporin分类和命名国际委员会(Committee of Parasporin Classification and Nomenclature)，并构建了抗癌晶体蛋白完善的分类系统。与Cry及Cyt蛋白的分类命名一样，根据氨基酸序列的同源性，把现已发现的Parasporin蛋白分划为4种不同类型：Parasporin 1-4(http://parasporin.fitc.pref.fukuoka.jp/intro.html)。通过对目前已有的4类PS蛋白进化分析，结果表明它们存在很少的亲缘关系，而这四种PS蛋白在抗癌毒性谱和活性水平上有显著差别。两种分子量较低的蛋白PS2和PS4具有相对较宽的杀细胞谱，每个都能诱导6个人类癌细胞系死亡，而具有典型三域结构的PS3蛋白具有最窄的活性谱，仅对两个癌细胞系HL-60和HepG2存在中度细胞毒性。与Cry和Cyt蛋白的活化相似，Bt菌株合成的抗癌晶体蛋白也属于无活性的原毒素，需要在碱性溶液中经过蛋白酶水解之后才能产生有活性的抗癌蛋白，并且不同的蛋白酶处理对不同菌株蛋白的活化效果也有很大差异。上述四种PS蛋白未经蛋白酶处理时，不具有杀死癌细胞的活性，或由于内源酶的水解活化而具有极低的抗癌活性。