[发明专利]利用RNA聚合酶突变提高环脂肽类抗生素产量的突变体及制法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及产抗真菌环脂肽类抗生素的芽孢杆菌CC09菌株的RNA聚合酶突变体的筛选及其应用。

背景技术

随着人们对生活质量要求的提高以及环境生态面临的种种危机，农业生产面临的最大挑战就是如何在未来能够找到环境友好型的化学农药的替代品来抵抗农业病害，随着各国科学家的研究发现，源于有益微生物的生物农药是最有希望成为这类产品的替代品(Marc Ongena等，Cell，2007，16(3)：115-125)。现有有关微生物农药的研究多集中于芽孢杆菌，且已有相关产品出现，如美国Agraquest公司的产品SerenadeTM和Sonata AS，就是来源于菌株Bacillus subtilis QST713和QST2808(Cao CX等，Agric.Nat.Resour，2010，SAG-18-10.)。

芽孢杆菌的抗菌物质多为环脂肽类抗生素，如Iturins和Surfactin等。该类抗菌物质往往产生于微生物的稳定生长期，产量低是制约其开发为生物农药的主要原因。

目前用于提高芽孢杆菌代谢产物中抗菌物质的方法主要有：优化培养基组成，如在玫瑰孢链霉菌培养液中添加缬氨酸可以提高达托霉素的前体物环肽A21978C2的产量，添加异亮氨酸可以提高同为前体物的环肽A21978C1和A21978C3含量，进而增加达托霉素的产量，添加亮氨酸则可以生成新的衍生物(Zmijewski M J等，J Antibiot，1986，39(10)：1483)；前体控制发酵工艺，改变环脂肽类抗生素肽尾上的脂肪酸和特定位置的氨基酸，以提高其目的组分产率或生成新的衍生物(Boeck L D等，J Antibiot，1990，43(6)：607)；利用诱变处理，筛选高产环脂肽菌株(李晶等，安徽农业科学，2008，36(1)：106-111，132)。寻找更为有效的方法及高产量菌株仍是目前研究的重点。

本发明核心突变体来源于芽孢杆菌CC09制成的生防菌剂(专利申请号CN201110073773.9)，该生防菌剂对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、链格孢菌(Alternaria alternata)、水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和辣椒疫霉(Phytophthora capsici)等的生长有显著的抑制活性，特别对小麦白粉病和赤霉病有显著的防治效果。本发明以此生防菌为基础，通过定向筛选RNA聚合酶自然突变体，获得了环脂肽类抗生素产量提高100％～300％的突变体，为环脂肽类抗生素的产业化生产提供了一条新的途径和生产菌株。

发明内容

本发明主要目的是：提供一种利用RNA聚合酶突变提高环脂肽类抗生素产量的技术，获得环脂肽类抗生素产量提高的芽孢杆菌CC09(专利申请号CN201110073773.9，该菌株已于2011年3月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4669)的RNA聚合酶突变体，并应用于植物病害的防治。

本发明的技术方案：

1.CC09菌株RNA聚合酶突变体的获得

菌种的活化

将菌株CC09于LB液体培养基中活化，然后接种于8支含LB液体培养基的试管中进一步培养。

突变菌筛选平板的制取

将LB固体培养基加热融化后，加入一定浓度的利福平溶液于已融化的培养基中，摇匀后在无菌条件下以20-30ml的量倒于直径为90mm的平板中。

将中8支原始菌种种子液，分别以每平板200μL的接种量均匀涂布于8个法制得的平板上。37℃暗处培养2天后取出，所见菌落即有可能为RNA聚合酶突变体，进而通过对该突变体中rpoB基因的PCR和PCR产物的序列分析，进一步确定突变体的突变基因是否发生在编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因上。

2.高产突变体及其环脂肽类抗生素含量的确定

通过抑制植物病原真菌活性实验和HPLC检验，确定高产突变体的抗真菌活性及所产生的环脂肽类抗生素的含量。

3.高产突变体突变基因位点的确定

利用细菌DNA提取试剂盒，提取个突变体的DNA，并用一系列引物进行PCR扩增，获得完整的rpoB基因序列，经序列分析以及与野生型菌株rpoB序列的同源性比对，找出突变碱基及相应的氨基酸。

4.突变体及其产生的环脂肽类抗生素对植物病原真菌的防治实验

突变体的发酵液及其无菌滤液分别进行抗植物病原真菌实验。

本发明与现有技术相比的有益效果：