[发明专利]一种克隆表达腈水合酶调控蛋白的方法

说明书

技术领域：

一种克隆表达腈水合酶调控蛋白的方法，具体涉及一种在大肠杆菌BL21中表达腈水合酶调控蛋白的方法。 

背景技术：

腈水合酶(Nitrile hydratase，简称NHase，EC 4.2.1.84)，是一种催化腈基化合物转变为酰胺基化合物的金属酶。用这种酶所生产的丙烯酰胺已近百万吨，占整个丙烯酰胺产量的三分之一。生物技术相对于传统的化学法有着成本低、能耗少、少污染的优势。目前，在美国、日本、法国等发达国家，这项生物技术正在取代传统的化学法。在我国，腈水合酶合成丙烯酰胺的生物技术虽然起步较晚，但发展很快，2008年数据统计，我国生物法生产的丙烯酰胺占整个丙烯酰胺产量的41％。丙烯酰胺是一种应用广泛的基础化工原料，在石油开采、造纸、装潢等方面发挥着重要的作用。随着市场的不断拓展，对丙烯酰胺的需求也在不断增长。另外这种酶也被应用在尼克酰胺的生产上。尼克酰胺是一种B组维生素，以辅酶I及辅酶II的形式参与机体代谢，在人体和动物代谢方面起着十分重要的作用，广泛应用在医药、食品添加剂及饲料生产上。 

腈水合酶的广泛应用促使科学工作者开始研究这种金属酶的合成机制和催化机理。腈水合酶按所含金属离子的不同分为含铁和含钴两种，按基因结构的不同又可以分为四类。虽然它们催化的是同一类化学反应，这几类酶的合成模式却不同，这些不同突出表现在金属离子摄取方式的不同。其中第一类和第二类腈水合酶中钴离子的摄取机理已经判明，而第三类还没有报道，第四类腈水合酶(含铁型)的相关结论也不明确。阻碍探明第三类钴离子摄取机理的关键原因就是该类腈水合酶(以恶臭假单胞菌腈水合酶为代表)调控蛋白目前尚无成功克隆表达的方法。其原因在于：目前恶臭假单胞菌中腈水合酶调控基因序列的ORF部分报道有误，而且即使正确识别该调控蛋白的ORF，该调控蛋白在SDS-PAGE上也很难检测到。 

发明内容：

本发明提供了一种识别腈水合酶调控蛋白的开放阅读框，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。 

本发明还提供了一种应用上述开放阅读框克隆表达腈水合酶调控蛋白的方法。 

为解决上述问题，提供技术方案如下： 

1)从NCBI上下载GenBank号为U89363.1的序列并且识别SEQ ID NO.1； 

2)在调控蛋白基因序列前加SD序列(AAGGAG)和His-tag序列； 

3)将上一步骤中构建的序列串联在腈水合酶成熟酶下游克隆到pET-24a(+)，导入大肠杆菌BL21诱导表达； 

4)HPLC检测改造后腈水合酶酶活。 

本发明所述腈水合酶基因是来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRL-18668(“A stereoselective cobalt-containing nitrile hydratase”发表在1997的Biochemistry)。 

本发明的详细的步骤为： 

(1)获得正确的调控蛋白基因序列并识别正确的ORF 

通过查阅恶臭假单胞菌中腈水合酶基因序列设计引物分别正确扩增成熟酶基因序列和调控蛋白基因序列。由于目前恶臭假单胞菌中腈水合酶调控基因序列的ORF部分报道有误(该调控蛋白基因序列有3种可能的ORF)，而且该调控蛋白在SDS-PAGE很难检测到，所以给正确识别调控蛋白的ORF增大了难度。通过尝试各种ORF并且在该调控蛋白N端加His-tag保护，对成功表达出有活性调控蛋白的ORF，最终确定为正确的调控蛋白ORF； 

(2)调控蛋白基因序列N端加His-tag 

大肠杆菌BL21中表达恶臭假单胞菌中天然的腈水合酶全序列，国际上已多有报道其调控蛋白不能成功表达，通过在调控蛋白基因序列N端加His-tag，可成功表达调控蛋白； 

(3)重叠PCR串联腈水合酶成熟酶与调控蛋白基因序列 

通过重叠PCR将腈水合酶N端加有His-tag的调控蛋白基因序列串联在成熟酶基因序列下游； 

(4)克隆到pET-24a(+)导入大肠杆菌BL21中表达 

将上一步骤中构建的腈水合酶全序列克隆到pET-24a(+)导入大肠杆菌BL21中诱导表达； 

(5)HPLC检测改造后腈水合酶酶活 

腈水合酶HPLC检测条件：流动相磷酸乙腈缓冲液；检测波长210nm；色谱柱采用C18柱； 

(6)腈水合酶调控蛋白N端测序