[发明专利]一种猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型菌株及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于动物疫苗工程技术领域，更具体涉及一株猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT，同时还涉及一种猪胸膜肺炎放线杆菌的制备方法，该方法适用于高密度发酵猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT及其他血清型菌株，以大量制备抗原用于猪传染性胸膜肺炎单价或多价疫苗。

技术背景

猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP)是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的以胸膜肺炎和出血性坏死性肺炎为特征的一种重要的猪呼吸道传染病。其病原猪胸膜肺炎放线杆菌是高度专一寄生于猪呼吸道的一种革兰氏阴性致病菌，病原本身根据研究年代的不同就曾经被划分于不同类属的细菌，经历了一系列从表型鉴定到基因鉴定的过程，其毒力因子和保护性抗原因素复杂，目前为止根据其荚膜多糖和脂多糖抗原差异共有15个血清型，导致所引起疾病的病原学因素复杂，目前该病在全球呈暴发流行，对世界养猪业造成了巨大危害。自我国发现PCP流行以来，很多科研工作者对该病的病原学、流行病学、诊断及免疫防制等方面都进行了大量的研究，取得了一定的成就。但目前该病在我国发病率仍逐年上升，有的猪场阳性率已达到70％以上，血清型有1、2、3、5、7与8型等，已经成为当前集约化猪场的主要传染病之一，严重危害着我国的养猪业。而且，APP产生的毒力因子对肺部防御系统的破坏，使得此病往往与副猪嗜血杆菌病、猪肺疫、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病等疾病混合或继发感染，进一步加大疾病的危害，使之已成为危害养猪业最严重的疾病之一。疫苗免疫作为疾病防控的重要手段，随着对该菌毒力因子在致病性和免疫保护作用研究的深入，国内已经有针对性防治猪胸膜肺炎放线杆菌血清型1型、3型、5型、7型感染的单价或多价疫苗的报道，但由于不同血清型所分泌毒素及表面抗原差异巨大，往往导致对其他血清型猪胸膜肺炎放线的保护效果不佳，而由于我国地域广阔，又从许多国家进口生猪，导致现有疫苗在对某一或几种血清型株到达防治效果的同时，又会导致其他血清型的分离率上升，而猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型是在一种在全球广泛流行的血清型，因此筛选到一株抗原效果好的2型菌显得尤为必要。另一方面，长期以来我国细菌性疫苗的关键生产技术中，大规模的菌体高密度培养技术严重滞后，对猪胸膜肺炎放线杆菌的培养没有系统优化的培养基和针对其生长特性的培养条件控制手段，导致企业的生产成本高、效率低，从而使产品价格相对较高，影响了免疫普及率。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型菌株，该菌具有适合用于灭活疫苗制备的毒力强，抗原效果好，保护力高等优点。

本发明的另一个目的是在于提供了一种猪胸膜肺炎放线杆菌的制备方法，该方法具有原料来源广泛、价格低廉、质量可控，菌体生长快、密度高，易于控制等优点

为了实现上述的目的，本发明通过以下技术方案完成：

其技术构思是：猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型菌株的分离、筛选和鉴定：申请人从湖南湘潭市某猪场送检的病料中分离并鉴定得到一种猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型菌，该菌株命名为猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2XT，XT为分离地湘潭拼音首字母)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：M2011410

1.1病料分离：无菌取濒死猪肺、咽喉扁桃体等组织，接种到TSA琼脂培养上，10％CO₂、37℃条件下培养24～36h后挑选典型的单个菌落进行纯化培养。挑选纯化好的单菌落接种于TSB液体培养液中，37℃摇床(220r/min)培养过夜。

1.2采用显微观察、PCR法、生化鉴定及琼脂扩散验进行了分类和分型鉴定，具体步骤如下：

1.2.1PCR鉴定

模板的制备：用接种环挑取数个纯化后的菌落至装有40μL无菌三蒸水的EP管中，水煮5～10min，立即放入冰水混合物中，待完全冷却后，12000r/min离心3min，取上清4℃保存备用

PCR引物序列：P1：5’CCGACTTTTAAATCCGT3’；P2：5’GAACAGTTGTTCGCTAA3’