[发明专利]一类双苄基五甲川菁荧光染料、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一类双苄基五甲川菁荧光染料，其制备方法以及作为特异性荧光探针在活细胞和固定细胞标记中的应用。

背景技术

线粒体是一种普遍存在于真核细胞中的细胞器，各种生命活动所需的能量大部分都是靠线粒体中合成的ATP提供的，因此有细胞的“动力工厂”之称。目前商品化的线粒体荧光探针主要有：JC-1、Rhodamine 123及系列探针。其中，JC-1应用最为广泛。它在浓度或线粒体膜电位低时，以单体存在，激发波长为490nm，发射波长为527nm，呈绿色荧光。当浓度升高或线粒体膜电位升高时，JC-1形成J-聚体，呈橙色荧光，此时激发波长为490nm，发射波长为590nm。JC-1最重要的应用是检测活细胞内线粒体的膜电位，以及追踪凋亡细胞中的线粒体变化。Rhodamine 123是一种能渗透入细胞，带阳离子的荧光探针。它的激发波长为505nm，发射波长为534nm。活细胞摄取Rhodamine 123达到平衡的速度较快，只需5分钟，通过激光扫描共聚焦显微镜观察，即可见到线粒体被Rhodamine 123染成绿色。当细胞被反复冲洗时，Rhodamine 123通常不被细胞保留，但许多癌细胞可较长时间保留这种染料，因此，它有助于某些癌症的诊断。但是，一旦线粒体的膜电位损失，它们就很容易被洗掉。这就限制了某些应用。系列探针则是Invitrogen专为线粒体而设计，具有细胞通透性，能被动渗透质膜，在有活性的线粒体中积累。尽管有些MitoTracker探针能实现固定细胞中的线粒体标记，但在很短的时间内就会匀染整个细胞，所以这些染料还是只推荐给活细胞。

因此，目前的线粒体荧光探针都存在着不同的缺点，如受线粒体膜电位控制、不能标记固定细胞中的线粒体等。更为重要的是，这些探针的吸收和发射波长均在可见光区(490-530nm)，而生物样品在这个区域有很强的吸收和荧光发射，这会造成荧光检测效率大大降低。

随着生物技术和荧光标示技术的飞速发展，由于菁染料具有摩尔消光系数大，吸收和发射波长随着染料共轭链的长度可调，与生物分子结合后荧光较强，细胞毒性小等特点，已成为在DNA、蛋白质及核酸等分析检测中使用的主要荧光探针。五甲川菁染料Cy5的吸收、发射波长在600nm以上，接近近红外区域，是波长最短的近红外菁染料，作为新一代的商品化荧光标示剂，在蛋白标记、DNA测序、离子中性小分子识别、细胞以及活体组织成像方面得到了很广泛的应用。但到目前为止，还没有文献报道五甲川菁染料用于荧光特异性标记细胞内线粒体。

发明内容

本发明的目的在于提供光谱范围在近红外光区、能够在活细胞和固定细胞中对线粒体进行荧光标记的、结构简单性能优良的基于五甲川菁染料的探针分子，

本发明的目的之一在于提供一类双苄基五甲川菁荧光染料，具有如下结构通式I：

通式I中，X^-选自卤素负离子、ClO₄^-、PF₆^-、CF₃^-、BF₄^-、R₁CO₂^-、R₂SO₃^-或OTs^-，

其中R₁和R₂各自独立地选自C_1-12的烷基或芳基。

优选的技术方案中，所述的R₁和R₂各自独立地选自C_1-6的烷基。

更进一步优选，通式I中，X^-选自卤素负离子，最优选Cl^-、Br^-、I^-。

本发明另一方面的目的在于提供上述本发明的双苄基五甲川菁荧光染料的制备方法，是使用通式化合物II与化合物III(缩合剂丙二醛缩苯胺盐)在碱存在条件下反应所得，反应溶剂是酸酐，反应温度20～150℃，反应时间10～100分钟。其中优选的反应时间是30～50min。