[发明专利]一种豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法

说明书

技术领域

一种豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，具体说是采用豌豆研磨成粉，用水浸提，高速离心，热处理，上清液通过DEAE-52离子交换层析，获得较纯的天冬氨酸蛋白酶抑制剂制品，属于植物提取生物活性产品技术领域。

背景技术

生物活性物质是指有些食物含有多种具有生物活性的化合物，能与机体作用后引起各种生物效应。它们种类繁多，有糖类、脂类、蛋白质多肽类、甾醇类、生物碱、甙类等等。它们主要存在于植物性食物中，有的对人有利，有的有害。在预防和治疗疾病，食品等领域，生物活性物质仍是一个值得研究的课题，如何开发利用生物活性物质对人体有利的一面，避免或消除其有害的一面值得我们进一步去探讨。目前国内外已从豌豆中分离出多种活性物质。

蛋白酶抑制剂是一类具有结合并使蛋白质失活从而对生物体内的某些酶起抑制作用的活性物质。天然蛋白酶抑制剂是一种能够抑制蛋白水解酶活性的小分子蛋白或多肽，它的来源十分广泛，在很多的动植物的组织器官及某些微生物中都有存在。按照其抑制的目标蛋白酶的活性中心的不同，大致可以分为以下几种：丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin）：如胰蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor IT）；半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cys-C）：如木瓜蛋白酶抑制剂；天冬氨酸蛋白酶抑制剂：如HIV蛋白酶抑制剂，胃蛋白酶抑制剂、蛋白酶A抑制剂和血管紧张肽原酶抑制剂；金属蛋白酶抑制剂：如羧肽酶抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂（ACE）等。蛋白酶抑制剂在食品、医药和农业等领域有非常广泛的应用前景。例如蛋白酶抑制剂具有抑制昆虫肠道中蛋白酶的活性，可作为生物农药或利用基因工程提高植物的抗虫性。

天冬氨酸蛋白酶是一类重要的蛋白水解酶，它的活性中心由两个天冬氨酸残基组成。天冬氨酸蛋白酶具有消化食物蛋白、降解抗原、病毒蛋白及酶的成熟、调整血压等方面的活性功能，这些蛋白酶是导致艾滋病、恶性肿瘤、高血压等世界上几种难治疾病的发病因素之一。深入了解天冬氨酸蛋白酶抑制剂，对治疗这些顽固性疾病将有一定的帮助。

目前国内外报道的天冬氨酸蛋白酶抑制剂大多数都是通过化学法合成的，往往因其药理毒性和安全性得不到保证限制了其应用，天冬氨酸蛋白酶抑制剂广泛存在于动植物的组织器官及某些微生物中，因此从天然产物中开发此类蛋白酶抑制剂日益受到人们的关注。

豌豆属豆科植物，学名为Pisum sativum L.。我国是世界上最大的豌豆种植国，年产豌豆500万吨，占世界总产量的40.7%。豌豆所含营养极为丰富，它不仅能提供大部分的碳水化合物(淀粉含量约为50%)，而且是供人们食用和动物饲用的重要蛋白质资源之一，豌豆含有20%～24% 的蛋白质，氨基酸的比例比较平衡。目前，市场上一大部分豌豆被用来制作粉丝。粉丝主要是利用豌豆中的淀粉，豌豆中的蛋白质就随着污水被排放掉了，不仅污染环境，同时也造成了蛋白资源的浪费。因此，开展豌豆资源的深度加工和全面综合利用方面的研究意义重大。

发明内容

本发明目的是提供一种豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，采用豌豆研磨成粉，用水浸提，高速离心，热处理，高速离心获得粗天冬氨酸蛋白酶抑制剂，再经DEAE-52离子交换层析，获得较纯的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，对胃蛋白酶的最佳抑制反应时间为1小时；热稳定性较好，100℃保温1小时后抑制活性几乎没有任何损失；pH稳定范围为2.0～7.0。对其进行底物特异性分析，知该抑制剂对同为天冬氨酸族蛋白酶的胃蛋白酶和凝乳酶有较高的抑制活性，对几种属于其它族的蛋白酶（木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶等）几乎没有抑制活性。

本发明的技术方案：一种豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，采用豌豆研磨成粉，用水浸提，高速离心，上清液进行热处理，再高速离心，上清液通过DEAE-52离子交换层析得纯化的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，再经过真空冷冻干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制剂干粉；其工艺为：

A豌豆上清液的制备：

（1）豌豆：市售；

（2）水浸提：豌豆研磨成粉后，与水按g/mL计1: 4（w/v）在4℃下进行浸提2 h，期间每隔半小时搅拌一次。浸提后以8000 r/min、4℃下离心30 min，取上清液；

（3）热处理：将上清液进行60℃下水浴20 min，8000 r/min、4℃下离心30 min，取上清；上清中蛋白质与糖的浓度比约为0.98~1.12，对胃蛋白酶抑制单位约为0.97 ~1.03 IU/mL，回收率 86.5%~ 89.4%；

B分离天冬氨酸蛋白酶抑制剂：