[发明专利]一种多功能化的石墨烯基因载体和基于该基因载体的基因转染试剂及其制备方法

说明书

技术领域：本发明涉及一种多功能化的纳米材料及其制备方法，尤其是一种多功能化的石墨烯基因转染试剂及其制备方法

背景技术：

基因转染过程是真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。基因转染技术不仅是研究转基因和基因表达的重要工具，而且是目前基因治疗的关键步骤。目前，主要的基因转染试剂为病毒型转染试剂与人工合成型转染试剂。病毒型转染试剂基因携带能力有限，缺乏靶向性，操作危险(Putnam，D.Nat Mater 5，439-451，2006)，因此人们更倾向于使用人工合成型的基因转染试剂。目前人工合成型基因转染试剂主要是阳离子脂质体类、阳离子肽类和阳离子聚合物类，或者是上述几种的复合物。然而，当前的人工合成型基因转染试剂同病毒型试剂相比，仍然具有较低的转染效率，并且毒性高。这在很大程度上限制了它的应用(Mastrobattista，E.，et.al.Nat Rev Drug Discov 5，115-121，2006)。

脂质体本身会参与细胞生理活动，引起基因表达的上调或下调。如参与蛋白激酶C通路调节(Bottega R，et al.Biochemistry 31，9025-30，1992)、抑制ATP酶的活性(Datiles MJ et al.Biochim Biophys Acta 1777：362-8.2008)、与线粒体膜发生作用(Beavis AD.J Biol Chem.264：1508-15，1989)、转染siRNA造成脱靶效应等等。脂质体这些作用是造成细胞毒性的根本原因，并对相关研究数据产生严重的干扰。目前新一代转染试剂的开发大多聚焦在非脂质体的阳离子聚合物上。

有证据显示，在阳离子聚合物类基因转染试剂中绝大多数聚合物分子处于游离状态(例如在聚乙烯亚胺体系中，游离聚合物分子占85％，这部分聚合物并不参与负载DNA，但是，在基因转染过程中它是导致其毒性的最主要原因(Lungwitz U.，et al.Eur J Pharm Biopharm 60：247-66，2005)。为改善其性能，人们尝试使用交联方法将阳离子聚合物制成纳米颗粒(Dong W.，et al.Acta Biochim Biophys Sin(shanghai).38：780-7，2006)、或将阳离子聚合物功能化到纳米粒子上，包括有机、或无机纳米粒子，并观察到毒性的降低。(David AG，et al.Angew Chem Int Edit，49，3280-3294，2010)

石墨烯作为一种新型的二维平面型材料，厚度只有单层碳原子，其尺寸可调；它很容易被引入各种官能团，如羟基、羧基、环氧基等，因此是一个理想的多功能化的纳米材料。初步的毒理学实验显示，石墨烯在细胞内(Chang Y，et al.Toxicol Lett，200，201-10，2011)和小鼠模型(Yang K，et al.ACS Nano 5，516-22，2010)中具有较低的毒性。

有文献报道，将聚乙烯亚胺通过物理吸附(Feng L，et al.Nanoscale，3，2011)或共价键(Chen BA，et al，J Mater Chem 21，7736-41，2011)连接到氧化石墨烯上，并观察到了毒性的降低。但是，通过物理吸附方法得到的聚乙烯亚胺功能化石墨烯不稳定，在盐水中沉淀。通过共价键连接到氧化石墨烯上虽然稳定，但是，与DNA质粒混合后，其稳定性仍然受溶液电荷性质影响严重，转染过程受操作方式、试剂用量等影响巨大，并且仍然存在一定的毒性。另外，其基因转染过程仅仅由阳离子聚合物一个因素控制，其转染效率仍然有限，对非肿瘤细胞的转染效率尤其低下。

因此获得更加稳定存在、并具有多个基因转染促进机制的多功能纳米基因转染试剂，仍然是当前基因转染试剂开发应用中的关键。

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种多功能化的石墨烯基因载体及其制备方法，以及基于这种多功能化的石墨烯基因载体的基因转染试剂及其制备方法。

多功能化的石墨烯基因载体是一种多功能化的石墨烯，由三部分组成，包括石墨烯，阳离子聚合物，和活性试剂，其中活性试剂包括表面活性剂、或细胞穿透肽(Cell-penetrating peptide)、或细胞核定位信号肽(Nuclear localization signal peptide)中的一种或几种，所说的阳离子聚合物和活性试剂连接到石墨烯上。