[发明专利]一种肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle5变体及其应用

说明书

一、技术领域：

本发明属生物技术领域，具体涉及一种肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle 5变体及其应用。

二、背景技术：

抗血管生成疗法作为一种新兴的抗肿瘤生物治疗方法，已经显示出了良好的抗肿瘤前景(Cao Y等，2004，Semin Cancer Biol 14：139-145)。人纤溶酶原Kringle 5(Human Plasminogen Kringle 5，hPK5)是人纤溶酶原的第5个Kringle结构域片段(Cao Y等，2002，Curr Med Chem Anticancer Agents 2：667-681)，hPK5是目前发现的抑制内皮细胞活性最强的纤溶酶原片段，具有许多优点(Yang X等，2010，J Cell Mol Med 14：2519-2530)：(1)具有强的生物活性，其抑制内皮细胞增殖的半数有效剂量(ED50)为50nmol/L，是血管抑素的1/3；(2)高度的细胞特异性，选择地作用于增生血管内皮细胞，而对静止的内皮细胞和其它细胞无毒性或毒性很低；(3)氨基酸片段短、分子量小，易于表达、分离和纯化；(4)副作用小，不会引起炎症反应；(5)性质比较稳定，适合于长时间缓慢释放。目前对hPK5的应用主要集中在眼球视网膜血管疾病的治疗上，而在抑制肿瘤局部血管生成中的应用尚处于基础阶段，hPK5自身优点决定了它在治疗肿瘤疾病中有潜在的临床价值和广阔的应用前景。

但是随着深入研究，尤其是近年来的临床试验结果显示，抗血管生成治疗中存在着一些问题：如在临床试验中，其临床疗效并不如人们预期的理想，在安全剂量用药时，抑瘤效果有限；人均几十毫克以上的蛋白用量，为生产、质量控制和生产成本都带来了巨大的挑战；而且如此大剂量的药物剂量也增加了产生副作用的可能性。因此，积极寻找安全有效的抗血管生成因子，提高其对肿瘤的靶向性，以降低用药剂量、增强抗肿瘤治疗效果，成为这一新型肿瘤生物疗法的新的研究重点。

hPK5是人纤溶酶原的第5个Kringle结构域，人纤溶酶原是人凝血系统中的重要组成分子，因此，如何在肿瘤治疗时，避免hPK5对其它组织的毒副作用，如何降低其使用剂量，这是hPK5在潜在的临床应用中面临的难题。

三、发明内容：

本发明的目的就是针对抗血管生成疗法中存在的问题和不足，寻找有效的抗血管生成蛋白， 提高其肿瘤靶向性，开发一种具有良好的治疗效果，且有效用药剂量较低，易于生产的新型抗肿瘤药物。

新生血管内皮细胞的分子组成与正常血管不同，一些血管生长因子受体和细胞基质金属蛋白酶等只能在肿瘤新生血管内皮细胞上表达，而很少在正常静止状态下的血管内皮细胞上表达。CNGRC基序是利用噬菌体展示技术筛选到的可以特异结合氨基酞酶N(Aminopeptidase N，APN)/CD13蛋白的配体，而APN/CD13只表达在肿瘤新生血管内皮细胞上，处于静止状态的正常血管内皮细胞很少表达(Pasqualini R等，2000，Cancer Res60：722-7)；更重要的是，近年来发现氨基酞酶N/CD13分子是肿瘤干细胞的分子标志物，与肿瘤的转移和预后相关联(Haraguchi N，Ishii H，Mimori K等，J Clin Invest.2010，120：3326-3339；Fontijn D，Duyndam MC，van Berkel MP等，Br J Cancer.2006，94：1627-1636；Fujii H，Nakajima M，Saiki I等，Clin Exp Metastasis.1995，13：337-344)。

为达到实现肿瘤坏死因子相关凋亡配体肿瘤组织靶向输送，提高其抗肿瘤疗效、降低其毒副作用的目的，本发明提供了一种肿瘤靶向性的hPK5变体蛋白，其特征是通过在hPK5蛋白的N端增加含NGR序列的新生血管靶向性肽和连接肽序列进行修饰，增强hPK5蛋白的肿瘤靶向性。

本发明是通过以下技术方案来实现的：一种具有肿瘤组织靶向性的hPK5变体，是具有序列表中序列1氨基酸残基序列的蛋白质，它是通过基因工程方法构建由CD13的配体、连接肽、hPK5的NGR-hPK5变体蛋白质，即利用常规基因工程方法通过人工合成或者克隆构建hPK5变体的编码基因、重组表达和分离纯化。所述CD13的配体是一种含有NGR序列的多肽，优选为一种带有环状结构的、含有NGR序列的多肽，例如短肽CNGRC。在NGR序列和hPK5之间必须有连接肽序列。