[发明专利]一种养殖和屠宰环境中喹诺酮类药物残留的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种养殖或屠宰环境中喹诺酮类药物残留的测定方法，具体是对牛、羊、猪、鸡、鱼或虾的养殖或屠宰环境的土壤或水体中喹诺酮类药物残留量的测定方法。

发明内容

目前在家畜、水产，特别是牛、羊、猪、鸡、鱼或虾养殖过程中，存在不规范使用甚至大量滥用喹诺酮类药物的情况，因动物的排泄物等原因，喹诺酮类药物不可避免地在相应的养殖环境和屠宰环境的土壤或水体中存在药物残留。喹诺酮类药物在环境中的残留首先会破坏生态环境，其次在环境中残留后，经与微生物作用后，环境中易产生耐药菌株，从而加速了动物自身对喹诺酮类药物的耐药性，进而又影响喹诺酮类药物的用量，形成恶性循环。为确保环境水和土壤的安全性，需针对水和土壤进行喹诺酮类药物残留的检测，但目前喹诺酮类药物残留主要都是针对动物源性食品本身的肌肉组织等作为检测对象，尚没有适合水体或土壤中药物残留的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可有效地检测牛、羊、猪、鸡、鱼和虾养殖和屠宰环境中喹诺酮类药物残留量的分析检测方法，本方法对样品的前处理过程快速简便，检测结果可靠灵敏。

本发明方法包括以下步骤：

(1)土壤样本避光静置30min后加入甲醇-水溶液，混匀，离心，移取上清液，重复提取一次，合并两次上清液，涡旋混匀，加水定容得样品提取液，或水样与等体积的PBS混合后加水定容，得样品提取液；将样品提取液加入到免疫亲和柱(IAC)，自然流出；依次用PBS、超纯水洗涤IAC柱；甲醇洗脱，流出的洗脱液用氮气吹干，再用甲酸-水溶液复溶，最后过0.22μm微孔滤膜；

(2)用液相-质谱/质谱进行分析测试，测得样品的色谱峰；

(3)将测得的色谱峰与已知喹诺酮类药物的标准色谱峰对照，准定喹诺酮类药物的具体品种及残留量。

所述的免疫亲和柱预先用15mL PBS平衡处理，流速为1ml/min。

本发明用免疫亲和柱对水或土壤样品进行前处理，再以高效液相色谱与质谱的联用的方法测定养殖或屠宰环境中喹诺酮类药物的残留量。样品前处理过程快速简便，处理后的样品检测结果可靠灵敏。

具体实施方式

(1)标准溶液的配制

喹诺酮类药物标准品用体积浓度为30％的甲醇溶液配制成浓度为1mg/mL的标准储备溶液，4℃保存；再用甲醇溶液逐级稀释成浓度梯度为1μg/mL的系列标准工作溶液。

(2)样品前处理

A.土壤样本的提取

准确称取2g土壤样本，避光静置30min后，加入8mL甲醇-水(4∶1，v/v)提取溶液，涡旋1min，振荡20min，3500rpm下离心，移取上清液，重复提取一次，合并两次上清液，涡旋混匀，用水稀释至40mL，得样品提取液。

B.水样本的提取

准确量取100mL自来水，避光静置30min后，取10mL水样与等体积的PBS混合。

C.过IAC柱预处理

IAC柱平衡：15mL PBS，流速，1ml/min；

上样：样品提取液加入到IAC柱，在重力作用下流出；

洗涤：20mL PBS、30mL超纯水洗涤IAC柱；

洗脱：4mL甲醇洗脱，自然重力下流出，氮气吹干，使用500μL甲酸-水溶液复溶，过0.22um微孔滤膜。

(3)液相-质谱/质谱测定

经前处理的样品提取液，进液相-质谱/质谱仪(HPLC-MS/MS)测定

HPLC-MS/MS仪器参数与测定条件如下：

A.仪器参数与测定条件如下表：

B.LC-MS/MS仪器测定

进样之前色谱柱需要平衡至少15min，重复进标准溶液，当峰面积变化±10％以内，保留时间±5％以内，方可正式开始进样。进样系列标准溶液浓度为2ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和200ng/mL

C.定性离子和定量离子的选择

14种喹诺酮类药物的LC-MS-MS参数

定性依据：阳性样品保留时间与标准相比±5％以内。

D.基峰与次强离子碎片丰度比符合以下标准：

定量依据：外标法定量，定量离子采用丰度最大的二级碎片

E.计算结果

外标法定量

用色谱数据处理机或按下列公式计算：