[发明专利]链霉菌Streptomyces sp.NK-660及其用于生产ε-聚赖氨酸的发酵培养方法

说明书

技术领域：

本发明涉及链霉菌新菌株及其应用，特别是涉及链霉菌Streptomyces sp.NK660用于生产具有抗菌活性的氨基酸均聚物ε-聚赖氨酸的发酵培养方法。

背景技术：

ε-聚赖氨酸(ε-Poly-L-Lysine，ε-PL)是L-赖氨酸单体通过ε-氨基和α-羧基脱水缩合形成的氨基酸均聚物，其结构式为：

ε-聚赖氨酸主要是由丝状细菌和真菌分泌产生的一种抑菌物质，对于革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和真菌具有广谱的抑菌活性。由微生物发酵合成的ε-聚赖氨酸聚合度一般为25～35。目前ε-聚赖氨酸已经由FDA批准作为食品防腐剂使用，具有安全性高、水溶性强等优点，并且在人体内分解为人体必需的氨基酸，是一种营养型防腐剂。

目前由于ε-聚赖氨酸生产菌株的生产能力较差，而且生产工艺复杂，因此，工业化生产受到限制。因此，分离生产能力强的ε-聚赖氨酸生产菌株和改善其发酵工艺都具有十分重要的意义。

发明内容：

本发明的目的之一是提供一株具有较强ε-聚赖氨酸生产能力的链霉菌Streptomyces sp.NK660。

本发明用于生产ε-聚赖氨酸的链霉菌Streptomyces sp.NK660，分离自福建古田地区地表土壤。该菌已于2011年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.5392；命名为链霉菌Streptomyces sp.NK660。

链霉菌Streptomyces sp.NK660的形态特征为：在贝纳特斜面上生长时初期呈凸起装半球形白色菌落，形成的菌丝将菌落牢牢固定在培养基上，不易挑起，菌落生长初期呈白色，且具有放射状褶皱，后期孢子逐渐成熟，菌落表面被灰色孢子覆盖。

菌体光镜下呈丝状，分生孢子丝呈螺旋状，孢子椭圆形，表面有刺状凸起。

链霉菌Streptomyces sp.NK660发酵培养特征为：在利用碳水化合物进行发酵过程中会产酸。

菌种的保藏条件为将孢子利用脱脂牛奶保护后真空干燥长期保藏，或制备砂土管对孢子进行保藏；该菌平时保藏于贝纳特斜面上，便于直接应用。

菌株的16SrDNA序列分析：利用16SrDNA通用引物，得到16SrDNA序列为1313bp；其16SrDNA序列在GenBank中进行同源性比对后发现，该菌株与链霉菌属具有100％同源性，结果显示该菌株属于链霉菌属，命名为链霉菌Streptomyces sp.NK660。

本发明的第二个目的是提供链霉菌Streptomyces sp.NK660CGMCC No.5392用于生产ε-聚赖氨酸的发酵培养方法。

为实现这一目的，本发明采取以下技术方案和操作步骤：

(1)将保存于贝纳特斜面上的链霉菌Streptomyces sp.NK660 CGMCC No.5392，挑取一环孢子接种在LB培养基中作为种子进行活化培养18-30h；

(2)将种子液以5-10％的接种量接种至以葡萄糖或甘油作为碳源的合成培养基中，通过摇瓶发酵或者30L自动发酵罐进行发酵培养72-96h；

(3)发酵结束后，发酵液6000～10000rpm离心处理10～20min去除菌体，收集上清，利用6M NaOH溶液将上清调整pH＝8，过滤祛除沉淀的杂蛋白；

(4)将过滤后的上清置于摇瓶中，利用弱酸型阳离子交换树脂吸附产物，将ε-聚赖氨酸分子吸附在树脂上；弃去吸附过后的上清，蒸馏水洗涤树脂，洗去未吸附的杂质；利用0.4mol/L的稀盐酸洗脱吸附的产物，洗脱液利用NaOH溶液将pH调整到中性；

(5)洗脱液利用冷冻干燥浓缩，浓缩液利用透过量1000Da的透析袋进行处理，去除无机盐离子，透析液冻干后得到ε-聚赖氨酸固体产物；

(6)进行¹HNMR和¹³CNMR图谱分析；MODI-TOF MS测定产物聚合度和分子量。

与现有ε-聚赖氨酸生产菌株相比，本发明的突出优点在于：相对于之前报道的生产菌株多为突变种，野生条件下产量不高。本菌株生产能力较强，发酵产量高，发酵生产方法更适于规模化生产。

具体实施方式：

在下面的实施例中所用菌种均为链霉菌Streptomyces sp.NK660 CGMCC No.5392，实施例中所用各种培养基及溶液、试剂配方如下：