[发明专利]一种核酸扩增与检测反应管

说明书

技术领域

本发明涉及一种实验器材，特别是涉及一种核酸扩增与检测反应管。

背景技术

聚合酶链反应技术(以下简称PCR技术)，是一种体外快速扩增DNA的技术。每个循环包括变性、退火和延伸三个过程，每经过一个循环，目的核酸分子的数目扩增一倍。经过30-40个循环，目的核酸分子数目扩增到原来的近10⁹倍。PCR是体外大量获得目的DNA片段的有效方法，便于对核酸分子做进一步的分析和检验。目前，PCR技术已广泛地应用于基础研究和应用研究。PCR作为一个“无细胞基因扩增系统”，在基础研究中可用于克隆基因，并在此基础上对基因组DNA进行直接序列分析，检测突变位点，分析染色体重组等。在应用研究中，则可以用于传染病的诊断、遗传疾病的检测及产前诊断、法医研究等。美国专利4,683,202；4,683,159；4,800,159；4,965,188对PCR技术做出了描述。

DNA的扩增在体内是由细胞内有关因子的参与下，双螺旋的DNA分子被解链成2条单链，在引物酶的作用下合成DNA引物。引物与单链DNA碱基互补配对，形成引物单链DNA复合物；在DNA聚合酶作用下，沿着5’-3’方向，按碱基互补配对原则，在引物3’端开始，逐一将互补的三磷酸脱氧核苷酸接上，最终形成一条新的双链DNA分子。

而DNA分子在体外的PCR扩增模拟了体内的三个步骤：首先，在大约95°C的高温下加热双链DNA样品，双链间的氢键会断裂，使得DNA热分解成两条互补的单链DNA分子，这一过程称为高温解链反应。然后，温度迅速降到大约50-65°C的范围内，在这个温度下单链DNA与引物按碱基互补配对原则结合，这一过程称为低温退火反应。退火反应结束后，温度要迅速升高到72°C左右进行延伸反应，在DNA聚合酶以及适当镁离子浓度的条件下，从引物的3’端开始结合单核苷酸，从而形成一条新的DNA。经过一个这样的过程，原来的一个DNA双链分子就形成了两个DNA分子，增加了一倍。反复进行高温解链-低温退火-中温延伸三个过程，就可以获得数量更多的复制双链，并且这些新形成的双链又可以作为下次循环的模板。

通过这样一种扩增方法，经过30-40个循环，目的核酸分子数目可由1个增加到原来的近10⁹倍。但PCR的高灵敏度始终伴随的弊端就是易污染。仅仅1个拷贝的污染就可能会使检测结果发生错误，因此，如何在PCR的全过程中避免污染也是现今核酸检测的一个重要研究方向。荧光PCR的出现使得对核酸产物的检测避免了开管取样的步骤，大大减少了核酸产物污染的机会。另外，UNG酶的使用也避免了PCR过程中核酸扩增产物的污染。除此之外，如何在试剂配制与加样等操作过程中避免污染，也需得到足够的重视。

目前，主流的PCR扩增技术的反应装置一般以温控金属块加热塑料制成的PCR反应管，通过金属块的加热、冷却，达到平衡温度后将热量通过反应管传递至PCR反应液。但是这种装置具有如下缺陷：

(1)耗时长，常规PCR完成30个循环一般需要2-3小时，其中大部分时间消耗于加热和冷却过程，即将金属块达到平衡温度并将热量通过反应管传递至PCR反应液；

(2)仪器结构复杂、成本昂贵且耗能较高；

(3)程序设置复杂，需经过培训的专业人员进行操作。

因此，PCR难以满足快速诊断、高效、高通量、野外检测、家庭自检等客观需求。

21世纪初，出现了一种新型的PCR扩增方法——利用自然对流(即雷诺-本纳德对流)原理进行PCR扩增的方法。该技术是将PCR反应液置于一个封闭的柱形反应腔内，反应腔的上下表面分别进行恒温控制，通常上端温度为60°C，下端温度为97°C。通过上下表面的温差驱动液体经过不同的温区，实现PCR扩增。这种方法不需要改变器件的温度，也不需要外加驱动来实现样品的流动，只需要一个反应腔，并控制其上下两端的温度为恒温，就可以实现PCR扩增。

传统PCR反应是要将试管静置于金属槽中并均匀加热，其试管因形状、材质、壁厚等因素，不能应用于上述的新型PCR方法。上述新型PCR方法中，反应管的形状是在管内建立稳定环流并成功扩增的关键因素。其中，热对流的发生依赖于流体中浮力与黏滞力的相对大小，能否形成环流，可根据雷利数——Ra(Rayleigh Number)来判定，其公式见下(1)：