[发明专利]一种血清多肽及以其作为定量参比物的质谱半定量方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种血清多肽及以其作为定量参比物的质谱半定量方法。

背景技术

质谱技术具有高分辨率、高灵敏度、高通量等特点，已经成为当前蛋白和多肽定量研究的首选技术。目前，基于质谱技术定量方法，有相对定量和绝对定量两个大的方面。其中，相对定量主要有稳定同位素标记方法、金属元素标记方法及基于色谱-串联质谱的非标记定量方法等；绝对定量技术方法主要有同位素稀释结合多反应监测质谱技术、金属元素标记结合电感耦合等离子体质谱技术等。

稳定同位素标记法克服了基于鸟枪法的定量分析中，多肽离子化效率和信号响应强度受多重因素干扰，直接用其质谱峰强度或者面积进行精确定量存在较大问题的缺陷。将不同样品来源的多肽分别标记“轻”质和“重”质同位素(如13C、15N和18O)，由于“轻”质和“重”质同位素标记多肽性质类似，具有相同色谱保留时间和离子化效率，此时成对出现的质谱峰信号可以准确地反映原样品中多肽及蛋白质的比例，从而可以进行精确定量。但是，准备同位素化合物需大量时间，并且试剂昂贵以及不同的同位素标记法适用范围的局限性使得同位素标记定量方法的广泛应用受到了限制。

对于金属元素标记方法的研究中，Whetstone等首次以化学性质很相近的稀土金属元素作为质量标签，提出了“元素编码亲和标签”的新方法，对标记了钇和铽元素标签的多肽色谱行为和质谱中的裂解行为做了初步的验证。Liu等使用二乙烯三胺五乙酸(DTPA)双酸酐键连到多肽的伯胺基，然后螯合稀土金属离子(Y和Tb)作为质谱检测的质量标签，Y和Tb标记的多肽在LC中共洗脱，其不同的离子化效率可经统计校准而获得蛋白质的相对定量。Ahrends等系统地考察了金属元素亲和标签(MeCAT)结合nano-LC/ESI-MSn的研究策略在蛋白质相对定量的可行性。四种不同镧系金属螯合物(Tb-、Ho-、Tm-和Lu-DOTA)标记的多肽在色谱中具有相同的保留时间，定量的线性动态范围为2个数量级，最低的检测量可达飞摩尔(10^-15mol)，平均标准偏差低于15％，并用LuMeCAT和Ho-MeCAT标记不同温度生长的酵母细胞的裂解液全蛋白样本，结合LC-MS，发现了56个表达差异的多肽和确定了相应的蛋白质的相对量。虽然上述研究得到了良好的结果，但是目前关于金属元素标签的标记方法研究尚不太多，其应用也相对较少。

昂贵的同位素标记试剂、繁琐的标记操作、受样品来源和样品数量的制约等标记方法的不足推动人们发展非标记的定量方法。非标定量法(Label-free)是通过比较质谱分析次数或质谱峰强度，分析不同来源样品蛋白的数量变化。在目前广泛使用的HPLC/MS/MSdata-dependent分析技术中，多肽的质谱分析次数与蛋白的丰度具有相关性，包括蛋白的肽段序列覆盖率、肽段匹配数、PMSS模型、emPAI等参数模型。但是，非标记定量技术同样也面临严峻的挑战：(1)要求LC-MS/MS分析具有良好的重现性；(2)对大量LC-MS/MS分析数据进行归一化处理和科学的统计。目前多种数据分析软件大大促进了非标记定量技术的应用，但非标记定量技术要达到精确和可靠的定量结果，还需进一步的完善及发展。

同位素稀释结合多反应监测质谱技术的定量方法，是目前高通量地对目标蛋白质进行绝对定量的重要方法之一。MRM-MS的基本工作原理是：在第一级四极杆(Q1)中选择性检测特定母离子，在第二级四极杆(Q2)中将母离子进行碰撞解离，在第三级四极杆(Q3)中选择性检测特定子离子。这样，只有符合设定值的母离子-子离子信号被特异性地检测到，有效地去除了大量干扰离子，而且M R M质谱扫描能同时监测多至300对的母-子离子对，因此MRM-MS具有灵敏度高、重现性好、准确度高和通量高等优点。将稳定同位素标记的内标肽加入到蛋白质酶切产生的内源性多肽中，由于内标肽和内源性肽具有相同的序列，因此它们具有相同的液相色谱保留时间、质谱离子化效率和二级碎裂离子。通过比较两者子离子信号强度，可计算出内源性多肽的量和对应蛋白质的量。但是，由于同位素试剂的昂贵，使得许多研究者不得不另辟蹊径。