[发明专利]一种人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种人工杂交六倍体油 菜小孢子再生植株的培养方法。

背景技术

芸薹属植物在十字花科中具有较重要的经济价值。芸薹属中包含了六 个最基本的品种类型，包括白菜型油菜(B.rapa，2n＝20，AA)、黑芥 (B.nigra，2n＝16，BB)和甘蓝(B.oleracea，2n＝18，CC)三个二倍体种，以及甘 蓝型油菜(B.napus，2n＝38，AACC)、芥菜型油菜(B.juncea，2n＝36，AABB) 和埃塞俄比亚芥(B.carinata，2n＝34，BBCC)三个四倍体复合种，这就是著名 的禹氏三角(UN，1935)。这些芸薹属植物在遗传改良中具有很大的潜力， 每个种都存在独特的特异基因。例如，白菜型油菜具有较强的抗潮和抗寒 能力，特别是它具有较短的生育期，这些特征使得它在生产上具有很大的 价值，但是产量低以及易受病害则在某种程度上限制了它的推广。而埃塞 俄比亚芥却具有很强的抗病能力以及特殊的黄色种皮，但它的生育期长成 为了在生产上应用最大的障碍。在自然界中，芸薹属含有A，B和C三个 基因组的六倍体物种(AABBCC)是不存在的。但在其他物种中六倍体是 可以存在并且在生产上得到大量应用，例如六倍体小麦。近期的研究中， Tian E等人在题为“Synthesis of a Brassica trigenomic allohexaploid(B. carinata×B.rapa)de novo and its stability in subsequent generations” (Theoretical and Applied Genetics，2010，121，1431-1440)以及Pradhan 等人在题为“Successful induction of trigenomic hexaploid Brassica from a  triploid hybrid of B.napus L.and B.nigra(L.)Koch.”(Euphytica，2010，176， 87-98)的文章中，通过芸薹属不同物种间的杂交(B.rapa×B.carinata， B.nigra×B.napus，B.juncea，B.napus和B.carinata三者之间等)获得了 一种新型并且稳定的六倍体油菜，这种六倍体油菜包含芸薹属的三个基因， 对芸薹属作物的研究和芸薹属中ABC基因组作图等具有很大的影响。

自1982年Lichter首次报道油菜游离小孢子培养获得再生植株以来，芸 薹属作物，尤其是油菜的小孢子培养，小孢子的出胚率、出胚量以及胚培 养及再生植株方面都获得了很大的成功。但对于这种新型的六倍体油菜的 小孢子培养鲜有报道。我们知道甘蓝型油菜游离小孢子培养比较容易，但 芸薹属中的其他作物例如甘蓝属和芥菜属的小孢子培养难度比较大，尤其 是对于较难出胚的品种来说特别不易。因此，在这种人工杂交合成的六倍 体油菜中包含了ABC三个基因组，我们不能确定三个基因组同时存在的情 况是否会影响到小孢子培养的出胚率及胚的质量，从而对将来DH(doubled  haploid，双单倍体)群体的建立有障碍。因此，寻找一种适合六倍体油菜 小孢子培养的方法显得极其重要。

发明内容

本发明提供了一种人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法， 成功培育出了第一个人工杂交六倍体油菜小孢子来源的双单倍体群体，为 将来制作六倍体油菜遗传图谱以及与农业相关性状的QTL提供了很好的资 源。

一种人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法，包括以下步骤：

(1)取人工杂交六倍体油菜的花序作为小孢子培养的供体；

(2)将灭菌后的六倍体油菜花蕾加入到1/2B5-13培养基中研磨成悬浮 液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀；在所述沉淀中加入NLN-13 液体培养基，将小孢子细胞浓度调至3×10⁵～5×10⁵个细胞/mL后，再依次 加入秋水仙碱溶液和活性炭混合液，得到六倍体油菜小孢子培养的混合悬 浮液；

(3)将所述六倍体油菜小孢子培养的混合悬浮液在黑暗条件下于 30℃～33℃恒温热激处理1～3天后，在黑暗条件下于20℃～28℃培养10 天～15天，直至肉眼可见时，在黑暗条件下于20℃～28℃再震荡培养5天～10 天，得到子叶期胚状体；