[发明专利]一种人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法

权利要求书

1.一种人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于， 包括以下步骤：

(1)取人工杂交六倍体油菜的花序作为小孢子培养的供体；

(2)将灭菌后的六倍体油菜花蕾加入到1/2B5-13培养基中研磨成悬浮 液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀；在所述沉淀中加入NLN-13 液体培养基，将小孢子细胞浓度调至3×10⁵～5×10⁵个细胞/mL后，再依次 加入秋水仙碱溶液和活性炭混合液，得到六倍体油菜小孢子培养的混合悬 浮液；

(3)将所述六倍体油菜小孢子培养的混合悬浮液在黑暗条件下于 30℃～33℃恒温热激处理1～3天后，在黑暗条件下于20℃～28℃培养10 天～15天，直至肉眼可见时，在黑暗条件下于20℃～28℃再震荡培养5天～10 天，得到子叶期胚状体；

(4)将所述子叶期胚状体接种到含有细胞分裂素的再生培养基中，在 每天12小时～18小时光照和20℃～28℃下培养，形成再生芽；

(5)切取再生芽接种至不含激素的生根培养基中，在每天12小时～18 小时光照和20℃～28℃条件下进行生根培养，将根生长健壮的苗炼苗后移栽 到土壤里，得到再生植株，鉴定倍性。

2.如权利要求1所述的人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方 法，其特征在于，

所述1/2B5-13液体培养基，以1L计，组成为：NaH₂PO₄.H₂O 75mg，CaCl₂56.62mg，KI 0.375mg，KNO₃ 1250mg，(NH₄)₂SO₄ 67mg，MgSO₄·7H₂O 62.5mg，H₃BO₃ 1.5mg，MnSO₄·H₂O 5mg，ZnSO₄·7H₂O 1mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.125mg，CuSO₄·5H₂O 0.0125mg，CoCl₂·6H₂O 0.0125mg，5mg维生素B1， 0.5mg维生素B6，Na₂EDTA 18.65mg，FeSO₄·7H₂O 13.9mg，肌醇50mg， 烟酸0.5mg，蔗糖130g，1L无菌水，PH5.6～6.2；

所述NLN-13液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L和 蔗糖130g，PH 5.6～6.2；

所述秋水仙碱溶液的质量百分浓度为0.3％～0.8％；

所述活性炭混合液，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L、琼脂糖 2～5g和8～15g活性炭；

所述NLN液体培养基，以1L计，组成为：KNO₃ 125mg，Ca(NO₃)₂·4H₂O 500mg，MgSO₄ 61mg，KH₂PO₄ 125mg，H₃BO₃ 6.2mg，MnSO₄·H₂O 18.95mg， ZnSO₄·7H₂O 10mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg， CoCl₂·6H₂O 0.025mg，0.5mg维生素B1，0.5mg维生素B6，生物素0.05mg， 叶酸0.5mg，NaFeEDTA 36.70mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸5mg， L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，丝氨酸100mg，1L无菌水；

所述再生培养基，以1L计，组成为：NaH₂PO₄.H₂O 150mg，CaCl₂113.24mg，KI 0.75mg，KNO₃ 2500mg，(NH₄)₂SO₄ 134mg，MgSO₄·7H₂O 125mg，H₃BO₃ 3.0mg，MnSO₄·H₂O 10mg，ZnSO₄·7H₂O 2mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，10mg维生素B1，1mg 维生素B6，Na₂EDTA 37.3mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，肌醇100mg，烟酸 1mg，1L无菌水，蔗糖20～30g，琼脂粉2～4g，植物凝胶3～5g，1～3ml浓度 为0.5～1.5mg/ml的细胞分裂素以及PH5.6～6.2；

所述生根培养基，以1L计，组成为：NaH₂PO₄.H₂O 150mg，CaCl₂113.24mg，KI 0.75mg，KNO₃ 2500mg，(NH₄)₂SO₄ 134mg，MgSO₄·7H₂O 125mg，H₃BO₃ 3.0mg，MnSO₄·H₂O 10mg，ZnSO₄·7H₂O 2mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，10mg维生素B1，1mg 维生素B6，Na₂EDTA 37.3mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，肌醇100mg，烟酸 1mg，1L无菌水，蔗糖20～30g，琼脂粉2～4g，植物凝胶3～5g，以及PH5.6～6.2。