[发明专利]一种非接触式细胞三维共培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞、组织工程等领域，是一种非接触式细胞三维共培养方法。

背景技术

细胞共培养是通过一些特殊的培养技术所建立的体外培养方法，它可以最大程度地在体外模拟体内组织环境、维持多种细胞在体内的性状，观察细胞之间相互作用，调控细胞的行为。由于它保留了体内组织微环境的结构和作用基础，又体现了体外培养条件的可控性，因此是组织工程研究的热点，在科研以及临床等领域具有广阔的研究和应用前景。

实现细胞共培养的方法主要有直接接触共培养和非接触共培养。直接接触共培养是将不同类型的细胞在同一个培养体系中混合在一起进行共同培养，不同类型的细胞发生直接接触，不能彻底分开，因此存在着细胞分离纯化困难、免疫安全性差、容易引起病毒传播等问题，不适合临床应用。非接触共培养是使用半透膜等起分隔作用的薄膜将两种细胞分隔开进行共培养，起到隔离作用的分隔薄膜允许细胞分泌的生长因子自由交换，同时将不同类型的细胞进行了免疫隔离，有利于细胞分离，提高了安全性。

由于非接触共培养体系中不同类型细胞间的相互作用是通过可溶性生长因子介导的，因此非接触共培养体系中分隔薄膜截留分子量影响了不同分子量的可溶性因子通过分隔薄膜的扩散情况，截留分子量较大，较多种类的小分子量可溶性因子可以自由交换；截留分子量较小，较多种类的大分子量的因子则不能透过分隔薄膜。因此，分隔薄膜截留分子量的变化改变了共培养体系中起介导作用的可溶性因子的种类和分布，从而调控了不同类型细胞之间的相互作用。

另外，细胞在体内组织中是以三维状态生长的，研究表明传统的体外二维培养条件下的细胞不能真实反映体内细胞的形态、功能等特点，由此可知，需要发展可实现多种细胞三维非接触共培养的有效方法来调控共培养中目的细胞的多种行为。

然而，目前非接触共培养的常用方法是使用transwell小室，这种培养方法存在明显的缺点：1)价格昂贵，实验成本增加；2)只能实现细胞在二维条件下的共培养；3)不能控制膜的截留分子量；4)transwell体系基于24孔板或6孔板，不容易扩大规模。由于现有细胞共培养方法存在缺陷，限制了细胞共培养研究的发展，因此急需研发一种便捷实用的非接触式细胞三维共培养方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非接触式细胞三维共培养方法，从而实现调控共培养体系中目的细胞的多种行为。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

在培养容器中依次制备海藻酸钙凝胶层、壳聚糖膜层、海藻酸钙凝胶层，即形成三明治式复合凝胶；在制备海藻酸钙凝胶层过程中，将二种不同的细胞分别三维生长在复合凝胶中截留分子量可控的壳聚糖膜两侧的海藻酸钙凝胶层中，并于培养容器中添加培养液，从而实现在同一个培养体系中，两种不同细胞的非接触三维共培养；

或，在培养容器中依次制备海藻酸钙凝胶层、壳聚糖膜层、海藻酸钙凝胶层、壳聚糖膜层、海藻酸钙凝胶层，即形成五层的三明治式复合凝胶；在制备海藻酸钙凝胶层过程中，将二种或三种不同的细胞分别三维生长在复合凝胶中截留分子量可控的壳聚糖膜两侧的海藻酸钙凝胶层中，并于培养容器中添加培养液，从而实现在同一个培养体系中，三种不同细胞的非接触三维共培养，进而调控共培养体系中目的细胞的增殖、分化等行为。

所述三明治式复合凝胶为由海藻酸钠和壳聚糖所制备，可支持两种或三种细胞三维共培养；其中，海藻酸钠分子量范围为100-1000kDa，古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比例(GM比)范围为0.2-3；壳聚糖分子量范围为2-200kDa，脱乙酰度范围为50-100％。

所述截留分子量可控的壳聚糖膜为通过改变海藻酸钠或壳聚糖的分子量、浓度或作用时间来改变壳聚糖膜的截留分子量；

所述海藻酸钠和壳聚糖为经过细胞外基质主要成分(胶原、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、聚糖)来源的多肽化学修饰的改性海藻酸钠和壳聚糖。多肽包括精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)、苏氨酸-苏氨酸-丝氨酸-色氨酸-丝氨酸-谷酰胺(TTSWSQ)、缬氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-缬氨酸-亮氨酸-赖氨酸(VFDNFVLK)、苏氨酸-谷氨酸-天冬酰胺(TEN)；

所述三维共培养为静态或者动态条件下的细胞三维共培养。

所述不同细胞的非接触三维共培养为存在可能相互影响的二种或三种不同种类的细胞在复合凝胶中的三维共培养。