[发明专利]一种非接触式细胞三维共培养方法

权利要求书

1.一种非接触式细胞三维共培养方法，其特征在于：

在培养容器中依次制备海藻酸钙凝胶层、壳聚糖膜层、海藻酸钙凝胶层，即形成三明治式复合凝胶；在制备海藻酸钙凝胶层过程中，将二种不同的细胞分别三维生长在复合凝胶中截留分子量可控的壳聚糖膜两侧的海藻酸钙凝胶层中，并于培养容器中添加培养液，从而实现在同一个培养体系中，两种不同细胞的非接触三维共培养；

或，在培养容器中依次制备海藻酸钙凝胶层、壳聚糖膜层、海藻酸钙凝胶层、壳聚糖膜层、海藻酸钙凝胶层，即形成五层的三明治式复合凝胶；在制备海藻酸钙凝胶层过程中，将二种或三种不同的细胞分别三维生长在复合凝胶中截留分子量可控的壳聚糖膜两侧的海藻酸钙凝胶层中，并于培养容器中添加培养液，从而实现在同一个培养体系中，三种不同细胞的非接触三维共培养。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述三明治式复合凝胶为由海藻酸钠和壳聚糖所制备，可支持两种或三种细胞三维共培养；其中，海藻酸钠分子量范围为100-1000kDa，古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比例(GM比)范围为0.2-3；壳聚糖分子量范围为2-200kDa，脱乙酰度范围为50-100％。

3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述截留分子量可控的壳聚糖膜为通过改变海藻酸钠或壳聚糖的分子量、浓度或作用时间来改变壳聚糖膜的截留分子量；

并且所述海藻酸钠和壳聚糖为经过细胞外基质主要成分(胶原、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、聚糖)来源的多肽化学修饰的改性海藻酸钠和壳聚糖；多肽包括精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)、苏氨酸-苏氨酸-丝氨酸-色氨酸-丝氨酸-谷酰胺(TTSWSQ)、缬氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-缬氨酸-亮氨酸-赖氨酸(VFDNFVLK)、苏氨酸-谷氨酸-天冬酰胺(TEN)。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述三维共培养为静态或者动态条件下的细胞三维共培养。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述不同细胞的非接触三维共培养为存在可能相互影响的二种或三种不同种类的细胞在复合凝胶中的三维共培养。

6.按照权利要求1或5所述的方法，其特征在于：二种或三种不同种类的细胞包括下述组合之一，多来源干细胞和多来源体细胞之间、多来源体细胞自身之间、以及多来源干细胞或体细胞和转基因细胞或细胞株之间的共培养。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：其中，多来源干细胞，包括胚胎干细胞或成体干细胞；多来源体细胞是指从动物或人的各种组织中通过分离、培养而得到的已分化成熟的细胞；转基因细胞是指导入了人工修饰基因的细胞，该细胞能够表达所修饰基因的特定功能；细胞株是指通过选择法或克隆形成法获得的具有特殊性质或标志物的克隆化细胞群。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

两种或三种不同细胞的非接触三维共培养，进而调控共培养体系中目的细胞的增殖、分化等行为。

9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于：所述共培养体系中细胞的增殖、定向分化等行为指共培养体系中细胞出现的增殖、分化、迁移、组织化、或凋亡的行为。

10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述培养容器中为培养板的培养孔中。