[发明专利]一种似蛋白A亲和选择性的仿生整体材料及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种似蛋白A亲和选择性的仿生整体材料，以及抗体的纯化、分离和固载。 

背景技术

抗体是一类重要的生物分子，在疾病的诊断、治疗和生物学研究中具有重要的作用。抗体，尤其是单克隆抗体，由于在疾病治疗中的重要作用，每年有几百亿美元的市场（参见G. Walsh, Nat. Biotechnol. 2010, 28, 917-924）。抗体的使用，尤其是活体应用，对纯度有严格的要求，因而有效的纯化方法十分重要。亲和法是目前抗体纯化的主要方法，包括亲和色谱法和非色谱亲和技术。亲和色谱法由于具有可自动化和易规模放大等优点是抗体纯化的主流技术。亲和配体是亲和色谱获得专一选择性的核心。目前的亲和配体主要有：1）生物专一配体，包括蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L及其类似物以及抗原等（参见K. Huse, H.J. Bohme, G.H. Scholz, J. Biochem. Biophys. Methods 2007, 51, 217-231.）；2）假生物专一配体，其为对抗体具有高选择性的非生物分子，如染料、羟基磷灰石和金属螯合离子等（参见S. Ghose, B. Hubbard, S.M. Cramer, J. Chromatogr. A 2006, 1122, 144-152）；3）生物专一配体模拟物，其通常通过生物工程获得，如亲和蛋白质结合配体（Affibody）（参见P.A. Nygren, FEBS J. 2008, 275, 2668–2676）和蛋白质A模拟物（PAM）（参见G. Palombo, M. Rossi, G. Cassani, G. Fassina, J. Mol. Recogn. 1998, 11, 247-249; S. Kabir, Immunol. Invest. 2002, 31, 263-278）等。这几类配体各有优缺点：生物专一配体的优势是高选择性，但洗脱困难、稳定性差和价格高则是其缺点；假生物专一配体很好地弥补了生物专一配体的缺点，但选择性差是其最明显的缺点；生物专一配体模拟物很好地解决了前两种配体的缺点，但选择性没有生物专一配体高，而在稳定性和成本上不如假生物专一配体有优势。尽管存在明显的缺点，蛋白质A亲和色谱仍是目前抗体纯化最常用的技术（参见D. Low, R. O’Leary, N.S. Pujar, J. Chromatogr. B 2007, 848, 48-63）。但是很显然，发展高选择性、洗脱容易、稳定性高和价格低廉的亲和色谱介质对抗体的纯化具有重要意义。 

另一个方面，在疾病诊断和生物学研究等领域，抗体的使用常常需要将其固载到固体材料的表面。常用的抗体固载方法有物理包埋法、化学键合法和生物专一配体结合法等。物理包埋法最简单，但稳定性和免疫亲和力差。化学键合法涉及比较繁琐的化学反应，抗体与材料的结合强，但会造成对抗原结合位点的阻挡和占用，降低了抗体的亲和力和专一性。生物专一配体结合法通过蛋白A或蛋白G与抗体的Fc端专一结合，抗原结合区不受任何影响，保持了抗体原有的亲和力和专一性；但是，蛋白A或蛋白G的价格高、稳定性差。因此，发展使用简便、价格低廉和能保持抗体的亲和力和专一性的材料对抗体的应用如免疫分析等领域具有重要意义。 

发明内容

本发明提供一种似蛋白A亲和选择性的仿生整体材料及其制备方法。该整体材料具有类似于蛋白A的亲和选择性，可应用于抗体的纯化、分离和固载。该材料以苯硼酸和亲水性二胺分子形成的“分子团队”为亲和配体，在中性pH条件下与抗体上Fc区中的糖基专一性结合，同时，利用该整体材料独特的空间位阻作用限制其与非抗体糖蛋白上的糖基的结合从而提高对抗体结合的专一性。结合到该整体材料上的抗体使用温和的酸性溶液即可洗脱。 

一种在生理pH条件下可纯化、分离和固载抗体的仿生整体材料，它由三（2，3-环氧基丙基）异氰酸酯（TEPIC）为单体，以对巯基苯硼酸、N，N' –二(2-氨乙基) 乙二酰二胺（BAEO）为交联剂共同进行环氧开环，采用原位聚合的方法制得交联的骨架结构的苯硼酸功能化的多孔仿生整体材料，其中苯硼酸基团和N，N'–二(2-氨乙基) 乙二酰二胺的氨基形成硼-氮配位键，使其在生理pH条件下即可实现对抗体进行纯化、分离和固载。 

一种在生理pH条件下可纯化、分离和固载抗体的仿生整体材料的制备方法，包括以下步骤：