[发明专利]胚胎肾脏的体外器官培养方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及哺乳动物的胚胎肾脏的体外器官培养方法，特别是小鼠胚胎期肾脏的离体器官培养。

背景技术

体外器官培养属于组织培养的一种高级形式，它能再现器官的发育过程，模拟器官在不同状态及条件下的功能状态，是是了解器官发育过程，研究疾病致病机制及药物筛选的重要技术手段。

目前肾脏体外器官培养目前有：由Saxen L等于1966年发表于杂志InternationalJournal of Cancer上Cell contact and cell adhesion during tissue organization 1966May 15；1(3)：271-90.一文中，他们利用3.5cm培养皿，放入2ml培养基，将孔径5um左右的聚碳酸脂滤膜漂在培养基上或者用不锈钢网做支架支撑。然后将小鼠胚胎肾脏放置于滤膜上，置于气液交界处培养(参见附图1、图2)。最新的是2010年，Jamie A.Davies在杂志PLoSOne中发表的A novel，low-volume method for organ culture of embryonic kidneys thatallows development of cortico-medullary anatomical organization  2010May10；5(5)：e10550.一文提出了小体积培养方法。同样是利用3.5cm培养皿，改进之处在于利用孔底面积1平方厘米的硅胶圈和22mmX22mm的玻璃片组装培养孔，将胚胎肾脏直接培养在玻璃片上，加入85ul体积培养基培养，硅胶圈和培养皿之间的空隙用带抗生素的磷酸盐缓冲液填充维持培养皿湿度(参见附图3、图4)。

但是上述两种方法均受到使用需要使用特殊材料和占用较大空间限制，另外也未考虑到培养基体积和成分变化对肾脏培养产生的影响，阻碍了胚胎肾脏的体外器官培养技术的大规模应用以及其在药物筛选中的运用。

发明内容

本发明要解决的技术问题主要是现有培养方法需要特殊材料和占用空间大的缺陷。

本发明解决技术问题提供的技术方案是提供一种哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法。该方法包括以下步骤：

a、在多孔培养板的培养孔中放入尺寸与之适配的承载片，在培养孔底部构建出培养空间；

b、将取得的哺乳动物胚胎肾脏放置于承载片上，加入培养基，使肾脏处于培养基和空气的液-气交界处；

c、37℃培养箱中培养，然后每1到2天进行培养基换液。

其中，上述方法步骤a所述的多孔培养板为24孔培养板。

其中，上述方法中在在使用的多孔培养板的各孔间隙加入湿度平衡液，以减缓培养基挥发。

其中，上述方法步骤b中加入培养基后调整承载片于培养孔的底部的中心，哺乳动物胚胎肾脏或胚胎肾脏原基位于承载片的中部。

其中，上述方法c步骤中所述的培养基采用半量递增的方式换液，即每次换液时保留上次培养基体积的一半在原培养孔中，然后将比上次培养基体积的一半按体积分数还多增加6％-12％的新鲜培养基加入培养孔。

进行10天培养时，第1-2天按上次培养基体积的一半加入，第9-10天按上次培养基体积的一半加入最佳。

其中，上述方法步骤a中所述的承载片为透明玻璃圆片。

其中，上述方法中所述湿度平衡液为无菌的磷酸盐缓冲液或蒸馏水。

其中，上述方法中所述胚胎肾脏为分离的胚胎期10～13天的小鼠肾脏原基。

其中，上述方法中所述的肾脏放置方式为：将肾脏平放。即输尿管走向面与承载片平面平行的方式放置于承载片上。