[发明专利]人富血小板血浆的制备及在人间充质干细胞分离培养中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域中对人富血小板血浆的制备及在人间充质干细胞分离培养中的应用，尤其是可以常规方法由分离了红细胞以及白细胞与血小板的混合物后的废弃血浆、特别是目前尚未得到充分利用而废弃的人脐带血/血浆为原料，进一步制备得到包括但不限于供人间充质干细胞分离培养用的人富血小板血浆。

背景技术

    间充质干细胞（MSCs）是一种具有自我更新和多项分化潜能的多能成体干细胞。MSCs最早在骨髓当中分离得到，体外贴壁生长，呈梭形。除了可以向中胚层的成骨，成脂和成软骨方向分化外，MSCs被证明还可以跨胚层分化成多种细胞谱系，如肝细胞，肺细胞，肌肉细胞，神经细胞等。MSCs不表达HLA II类抗原，只表达极少量的HLA I类抗原，其免疫原性极低，因此在细胞移植中对配型要求低。MSCs在人体内分布广泛，目前已经可以从人体的多种组织中分离得到，包括了外周血、脂肪组织、脐带血、脐带、胎盘等组织。

MSCs可以为造血干细胞（HSCs）提供合适的微环境，多项研究表明，MSCs的存在促进了HSCs的增殖和造血干细胞移植后造血系统的重建。与单一的造血干细胞移植比较，MSCs与造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等疾病的治疗效果。此外，MSCs还具有免疫调节功能，能够抑制B淋巴细胞、T淋巴细胞、DC细胞等免疫细胞的增殖以及活化。因此，MSCs可以预防和治疗异体造血干细胞移植后产生的移植物抗宿主病（GVHD），避免在器官移植中产生的免疫排斥反应，以及治疗自生免疫性疾病，如红斑狼疮、风湿性关节炎和硬皮病等。由于MSCs具有增殖、分化和低免疫原性等特点，因而可以作为组织工程理想的种子细胞来源，进行组织修复和再生，并已经用于多种疾病的损伤或病变器官的修复，如心脑血管疾病、肝病、骨和肌肉衰退性疾病、脑及骨髓神经损伤、老年痴呆等，取得了显著的疗效。MSCs易于导入和表达外源基因，也是一种基因治疗的良好载体。因此，MSCs具有具有巨大的应用潜力和十分广阔的应用前景。

MSCs需要通过体外的培养和扩增，以达到临床应用的细胞数量。传统的MSCs培养体系中需要添加一定量的（10~20%）的胎牛血清（FBS），作为生长因子、微量元素等营养成分的来源。但使用动物血清生产的细胞产品常存在诸多问题：FBS批次间差异较大，降低了细胞培养的重复性和稳定性；存在异基因污染和免疫反应的风险，如Heiskanen等和Sundin等在用FBS的培养的细胞移植后，已发现了抗FBS蛋白的抗体(Heiskanen A et al., Stem Cells. 2007; 25; 197-202; Sundin M et al., Haematologica. 2007; 92:1208-15)。此外，FBS还会引起培养细胞的生理生化及代谢特性的改变，如可以引起MSCs培养过程中向软骨方向分化 (Yokoyama M et al., J Biosci Bioeng. 2008; 106; 46-50)等。特别是，动物血清中常可能含有由蛋白质构成的感染物和未知的动物传染病，可导致传播人畜共患病的更严重危险。

人富血小板血浆（PRP）是指相对于全血来说含有更高水平血小板的血浆。PRP目前在整形外科中已有广泛的应用，主要用于促进骨嫁接后的骨融合和提高骨密度，伤口修复以及用于软组织修复等。PRP中含有多种能维持MSCs增殖的生长因子，如血小板衍生生长因子（PDGFs）、β-转化生长因子（TGF-β）、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）等。并且随着血小板浓度提高，这类生长因子的浓度相应提高。成体外周血的PRP已经成功用于脂肪来源和骨髓来源MSCs的体外培养（Kocaoemer A et al., Stem Cells. 2007; 25: 1270-1278; Schallmoser K et al., Transfusion  2007；47：1436-1446）。