[发明专利]一种快速提取悬钩子属植物总RNA的方法

说明书

(一)技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种快速提取悬钩子属植物总RNA的方法

(二)背景技术

获得高质量总RNA是进行分子生物学研究如基因表达水平研究、基因操作如RNA干扰、转基因等下游研究的前提条件。悬钩子属植物的树莓、黑刺莓中富含有花青素苷、原花青素等多酚类次生代谢产物，这些物质给总RNA提取带来了重重困难：酚类化合物极易被氧化成褐色物质，然后与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失，或形成不溶复合物导致在用氯仿抽提时RNA的大量丢失。

商业试剂盒，比如Trizol试剂盒在应对该类植物总RNA提取时显得无能为力，而传统的总RNA提取方法如CTAB、SDS等需要较多的植物材料，且需要使用多步抽提来去除多糖、蛋白和基因组DNA。目前使用最多的方法是在植物细胞破碎后，使用LiCl进行RNA的选择性沉淀，达到去除基因组DNA或多糖的目的。但该方法最大的缺点是耗时太长，一般都选择沉淀过夜。若改成醇沉淀，DNA污染特别严重，需要进一步使用DNase处理，然后经过酚-氯仿抽提以灭活DNase，结果造成RNA的大量损失。另外，LiCl沉淀后的洗脱过程要求严格，因为残留的Li⁺，Cl^-会对后续的逆转录及PCR扩增产生负面的影响。

所以我们迫切需要一种更方便快捷，而且能有效去除多糖、多酚以及基因组DNA等物质的RNA提取方法。

(三)发明内容

本发明创造了一种适用于悬钩子属植物的简单、快速的总RNA提取方法。该方法的特征在于按以下步骤执行：

1)取离心管，向离心管中加入700～1000μl去糖缓冲液，并加入5～15μl β-巯基乙醇，于-20℃预冷5～10min；

2)取新鲜植物材料或经液氮速冻后-80℃保存的植物材料0.1～0.15g，加入0.1g交联聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷冻条件下研磨成粉状，迅速转移至步骤1)的离心管中，温柔上下颠倒混匀后于冰上静置10min；

3)在4℃下按照3200×g离心5～10min；

4)彻底去除步骤3)离心所得上清液，向沉淀中加入700～1000μl 65℃预热的细胞裂解液，涡旋1min，于55～65℃保温20～30min；

5)待步骤4)中的混合液冷却至室温后，按顺序加入细胞裂解液等体积的水饱和酚，1/80-1/50裂解液体积的pH调节剂，1/5裂解缓冲液体积的氯仿，剧烈震荡2min；

6)在4℃下按照16000×g离心5～10min；

7)将步骤6)离心所得上清液转入另一离心管，向管中加入适量核酸沉淀剂，于-20℃静置30min以上，在4℃下按照16000×g离心10min后弃上清液，保留沉淀；

8)将步骤7)离心所得沉淀用体积分数为70～75％乙醇洗涤后室温风干，用DEPC处理水溶解后-80℃保存；

其中，步骤1)、2)、3)、4)可以替代为步骤：

9)取离心管，向离心管中加入700～1000μl裂解缓冲液，并加入5～15μl β-巯基乙醇，于55～65℃预热5～10min；

10)取新鲜植物材料或液氮速冻后-80℃保存的植物材料0.1～0.15g，加入0.1g交联聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷冻条件下研磨成粉状，迅速转移至步骤9)的离心管中，涡旋1min，于55～65℃保温20～30min；

按上述方案，所述去糖缓冲液为：0.05M氯化钠、50mM pH 8.0的乙二胺四乙酸二钠、200mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷。细胞裂解液为：30g/L十六烷基三甲基溴化铵、1.4M氯化钠、50～100mM pH 8.0的乙二胺四乙酸二钠、100～200mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷以及20g/L聚乙烯吡咯烷酮K30。pH调节剂包括但不限于弱酸如冰醋酸、草酸。所述核酸沉淀剂包括但不限于无水乙醇、异丙醇，使用的无水乙醇体积为上清体积的2～2.5倍，使用异丙醇体积为上清体积的0.8～1倍。

按上述方案，所述方法适用于悬钩子属下的树莓、黑莓以及其他种或变种。所述植物材料包括叶片、花、花蕾以及果实。