[发明专利]一种快速提取悬钩子属植物总RNA的方法

权利要求书

1.一种快速提取悬钩子属植物总RNA的方法，其特征在于以下操作：

(1)取2ml离心管，向离心管中加入700～1000μl去糖缓冲液，并加入5～15μl β-巯基乙醇，于-20℃预冷5～10min；

(2)取新鲜植物材料或经液氮速冻后-80℃保存的植物材料0.1～0.15g，加入0.1g交联聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷冻条件下研磨成粉状，迅速转移至步骤(1)的离心管中，温柔上下颠倒混匀后于冰上静置10min；

(3)在4℃下按照3200×g离心5～10min；

(4)彻底去除步骤(3)离心所得上清液，向沉淀中加入700～1000μl 65℃预热的细胞裂解液，涡旋1min，于55～65℃保温20～30min；

(5)待步骤(4)中的混合液冷却至室温后，按顺序加入细胞裂解液等体积的水饱和酚，1/80-1/50裂解液体积的pH调节剂，1/5裂解缓冲液体积的氯仿，剧烈震荡2min；

(6)在4℃下按照16000×g离心5～10min；

(7)将步骤(6)离心所得上清液转入另一离心管，向管中加入上适量核酸沉淀剂，于-20℃静置30min以上，在4℃下按照16000×g离心10min后弃上清液，保留沉淀；

(8)将步骤(7)离心所得沉淀用体积分数为70～75％乙醇洗涤后室温风干，用DEPC处理水溶解后-80℃保存；

2.根据权利要求1所述步骤(1)、(2)、(3)、(4)可以替代为：

(1)取2ml离心管，向离心管中加入700～1000μl细胞裂解液，并加入5～15μl β-巯基乙醇，于55～65℃预热5～10min；

(2)取新鲜植物材料或液氮速冻后-80℃保存的植物材料0.1～0.15g，加入0.1g交联聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷冻条件下研磨成粉状，迅速转移至步骤(1)的离心管中，涡旋1min，于55～65℃保温20～30min；

3.根据权利要求1所述总RNA提取方法，其特征在于所述去糖缓冲液为：0.05M氯化钠、50mM pH 8.0的乙二胺四乙酸二钠、200mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷；

4.根据权利要求1或2所述总RNA提取方法，其主要特征在于使用碱性细胞裂解液裂解细胞，所述细胞裂解液为：30g/L十六烷基三甲基溴化铵、1.4M氯化钠、50～100mM pH 8.0的乙二胺四乙酸二钠、100～200mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷以及20g/L聚乙烯吡咯烷酮K30；

5.根据权利要求1或2所述总RNA提取方法，其特征在于在细胞彻底裂解后，再使用pH调节剂调节混合液pH，使用的pH调节剂包括但不限于弱酸如冰醋酸、草酸；

6.根据权利要求1或2所述总RNA提取方法，其特征在于使用的核酸沉淀剂包括但不限于无水乙醇、异丙醇；

7.根据权利要求1或2所述总RNA提取方法，核酸沉淀时，使用的无水乙醇体积为上清体积的2～2.5倍；使用异丙醇体积为上清体积的0.8～1倍；

8.根据权利要求1或2所述总RNA提取方法，其适用于悬钩子属下的树莓、黑莓以及其他种或变种；

9.根据权利要求1或2所述总RNA提取方法中植物材料包括但不限于果实、叶片及花。