[发明专利]一种绿色糖单孢菌α-淀粉酶的基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种α-淀粉酶的基因，特别是一种绿色糖单孢菌α-淀粉酶的基因及其应用。

背景技术

淀粉酶是可作用于可溶性淀粉、支链淀粉、糖元和α-1，4-葡聚糖等多糖，水解α-1，4-糖苷键的一类酶。一般来说根据淀粉酶的作用方式可分简单为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶广泛应用于食品、轻化工业、酿造、制药、谷物加工、石油开采等领域。根据来源的不同α-淀粉酶又可分为真菌α-淀粉酶和细菌α-淀粉酶，真菌α-淀粉酶是由曲霉属微生物发酵产生的一种α-淀粉酶。与细菌α-淀粉酶不同的是，真菌α-淀粉酶的最适作用温度为55℃左右，超过60℃开始失活，其水解淀粉的产物主要是高含量的麦芽糖和一些低聚糖及少量的葡萄糖。而细菌α-淀粉酶最适作用温度高(中温α-淀粉酶70～80℃，耐高温α-淀粉酶为95～105℃)，水解淀粉的主要产物是糊精。因此，细菌α-淀粉酶只能用于发酵工业，而真菌α-淀粉酶则广泛地应用于淀粉糖浆、低聚糖、啤酒、烘焙食品、面制品等的生产，具有十分广阔的市场前景。真菌α-淀粉酶从20世纪50年代开始相继在英国和美国作为食品添加剂应用于面包生产行业，在现代的淀粉糖浆、焙烤制品、啤酒酿制、生料酒精等行业已得到广泛的应用。随着现代制糖工业与发酵工业的发展及其对真菌α-淀粉酶的使用需求，使得真菌α-淀粉酶在现代工业酶制剂中占有显著地位，在淀粉糖行业真菌α-淀粉已逐渐替代β-淀粉酶而成为以淀粉为原料生产麦芽糖浆的关键酶。随着真菌α-淀粉酶需求量的日益增加及其相对较昂贵的价格，使得近年来越来越多的国内研究者开始关注真菌α-淀粉酶研究与开发工作。

真菌α-淀粉可以水解淀粉内部的α-1，4-糖苷键，终产物中主要物质为麦芽糖和低聚寡糖及少量葡萄糖的糖浆。真菌α-淀粉酶的一个重要的用途就是用于生产高麦芽糖浆，目前，欧美各国大多采用真菌α-淀粉酶作为糖化剂生产高麦芽糖浆，得到的麦芽糖浆其组成中麦芽糖占40％～60％，麦芽三糖约10％～20％，其它为葡萄糖、低聚糖和糊精等。在工业生产中真菌α-淀粉可以与β-淀粉酶和普鲁兰酶等脱枝酶配合使用，用于生产超高麦芽糖浆，其麦芽糖含量超过70％，甚至更高。

关于用于生产麦芽糖的α-淀粉酶的相关专利和研究报道，美国两项专利U.S Patent4604355和U.S Patent：6274355是关于麦芽糖淀粉酶(maltogenic amylase enzyme)的制备方法和使用的专利，这种酶已经由诺维信公司商品化，这种酶转化淀粉的直接产物不是麦芽糖而是麦芽三糖以上的高麦芽糖寡糖，比真菌α-淀粉酶容易控制而且生成的葡萄糖少，所以可以进一步结合用其它脱支酶的共同作用就可以将淀粉转化成高麦芽糖糖浆。Petrícek M也报道了从Thermomonospora curvata克隆到的一个新的芽糖α-淀粉酶基因，可以水解淀粉生成50％以上的麦芽糖和少量的葡萄糖(Petrícek M，P，KuncováM.Characterization of thealpha-amylase-encoding gene from Thermomonospora curvata.Gene.1992，112(1)：77-83)；YangCH也报道了从Thermobifida fusca克隆到一个新的芽糖α-淀粉酶基因，可以水解淀粉生成50％以上的麦芽糖和少量的葡萄糖，其同源性和前面Petrícek M报道的有98％的同源性(Yang CH，Liu WH.Cloning and characterization of a maltotriose-producing alpha-amylase gene from Thermobifida fusca.J Ind Microbiol Biotechnol.Epub，2007，34(4)：325-330)；2002年Ammar YB报道从Streptomyces sp菌属分离纯化到一种新型的麦芽糖α-淀粉酶(Maltose-formingα-Amylase)，这种酶在转化淀粉时在4小时内就可以将淀粉转化成58％的麦芽糖，27.5％的麦芽三糖，14.5％的麦芽四糖和五糖，而且不会产生葡萄糖(Ammar Y B，Matsubara T，Ito K，Iizuka M，Limpaseni T，Pongsawasdi P，Minamiura N.New action pattern of a maltose-forming alpha-amylase from Streptomyces sp.and its possible application in bakery.J Biochem Mol Biol.2002，35(6)：568-575)，它的水解淀粉的特性似乎是一种很有应用前景的麦芽糖α-淀粉酶，可惜其没有相关基因克隆的报道。国内关于麦芽糖α-淀粉酶基因的报道只有訾楠等报道从地衣芽孢杆菌克隆到生麦芽糖α-淀粉酶的基因，其水解淀粉的产物主要是麦芽糖和葡萄糖(訾楠，沈微，石贵阳，王正祥.地衣芽孢杆菌生麦芽糖α-淀粉酶的基因克隆与鉴定.应用与环境生物学报.2009，15(1)：130～133)。本人也从嗜热链霉菌(Streptomyces thermoviolaceus)菌属中克隆到一个麦芽糖α-淀粉酶基因，可以水解淀粉生成麦芽糖的含量达到50％的糖浆(中国专利申请号：201010045645.9)。