[发明专利]一种检测混合物中抗氧化活性化合物的方法

说明书

一、技术领域：

本发明属于色谱分析技术和活性化合物检测技术领域，更详细的说，是一种利用高效液相色谱和自由基检测系统在线检测混合物中抗氧化活性化合物的方法。

二、背景技术：

高效液相色谱是一种高效分离分析混合物中化合物的仪器和方法，配备不同的检测器，可以检测混合物中不同性质的化合物。常用的检测器有：紫外吸收检测器(UVD)、二极管阵列检测器(PDAD)、荧光检测器(FLD)、示差折光检测器(RID)、蒸发光散射检测器(ELSD)、质谱检测器(MSD)。这些检测器均以化合物的某种化学物理性质检测化合物，与化合物活性没有紧密联系。

抗氧化活性化合物在植物、动物组织、血液中广泛存在。一些食品中加入抗氧化剂以延长保质期。检测食品中抗氧化剂，以及检测植物、动物组织以及血液中的抗氧化活性化合物是当今食品安全检测研究、植物化学研究，天然抗氧化剂开发研究，药物代谢研究等等研究与技术领域不可或缺的部分。按照传统方法从动植物组织的提取物中检测抗氧化活性化合物是一项耗时费力的工作。因为检测混合物中未知的活性化合物的传统方法是分离纯化混合物中所有(尽量多)的化合物，然后逐一进行活性测试。这种方法消耗大量的人力、物力(大量溶剂、分离用填料和样品)和时间(几个月)，而且样品在长时间分离过程中可能发生氧化反应等变化。分离得到的化合物多数无活性，具有较高活性的化合物较少。即使在活性跟踪下分离纯化也同样存在流程长，人力、物力消耗大，效率较低的弊病。

检测食品、血液中抗氧化剂则要求知道抗氧化剂的结构性质等，才能确定检测方法，无法做到对未列入检测项目的抗氧化剂的检测。

鉴于以上种种情况，一种将高效液相色谱和自由基检测系统联用以快速检测混合物中抗氧化活性化合物和抗氧化剂的方法逐步发展起来。该方法相当于在高效液相色谱已有的可见紫外检测器的基础上再加上抗氧化活性检测器，这样一次色谱分析即可得到混合物中各个化合物的抗氧化活性数据，检测出已知的和未知的抗氧化活性化合物和抗氧化剂。

这类方法在国内仅有3篇文章发表，朱卉等选取H₂O₂及O₂^·-为检测自由基，检测了一种药品中抗氧化活性化合物。吴雷等以O₂^·-为检测自由基，检测了中药材麦冬中的抗氧化活性化合物。H₂O₂和和O₂^·-不稳定，系统需要用鲁米诺和连苯三酚或者过氧化氢，因此体系反应复杂，稳定性和灵敏度不理想。王小淞等选取DPPH自由基为检测用自由基，检测了黄芩根提取物中的抗氧化活性成分。DPPH自由基稳定，系统组成与使用ABTS自由基类似，但灵敏度不及ABTS自由基。国外有应用ABTS自由基的装置，但是由于没有应用缓冲器，不能避免由高压泵压力波动导致的信号噪音，使得方法灵敏度受到限制。

三、发明内容：

本发明的目的在于提供一种以高效液相色谱和自由基检测系统联用的装置和方法，检测动植物组织提取物，食品等混合物中的抗氧化活性化合物和抗氧化剂。从而为混合物中抗氧化活性化合物和抗氧化剂的检测提供一种灵敏度高，重复性好，操作简便，检测快速的方法，以消除传统方法费时耗力耗物，效率低下的弊端，以及同类方法稳定性和灵敏度较差的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种检测混合物中的抗氧化剂和抗氧化活性化合物的方法，是利用高效液相色谱分析混合物中抗氧化活性化合物以及抗氧化剂的分析方法，包括以下装置，参数设置和分析方法：

(1)装置：所需仪器有一套高效液相色谱仪HPLC(包括高压泵；进样器；可见紫外检测器；软件和计算机，配以C18液相色谱柱)，一台可见检测器，一个缓冲器，一台信号记录仪，一台高压泵，一个HPLC用“三通”和HPLC用塑料(PEEK)管道。

HPLC 的可见紫外检测器连接到一个HPLC用“三通”，“三通”另一路经缓冲器连接至输送自由基溶液的高压泵，第三路经由反应圈(HPLC用连接管道，材料为PEEK，内径小于等于0.25mm，长度为10.0-30.0的高压泵，第三路经由反应圈(HPLC用连接管道，材料为PEEK，内径小于等于0.25mm，长度为10.0-30.0m)连接至可见吸收检测器和一个信号记录器。

(2)参数设置：

①自由基选用ABTS自由基，浓度为0.32mmol/L，流速0.5-1.0mL/min，可见检测器检测波长为414nm。